SM22α泛素化對PDGF-BB誘導的VSMC增殖的影響.pdf

1、目的:泛素化修飾是一種重要的翻譯后修飾方式，受到細胞外信號的嚴格調(diào)控。我室研究證明，PDGF-BB可以誘導血管平滑肌細胞(VSMC)標志物——SM22α發(fā)生磷酸化和泛素化，并且該過程與SM22α蛋白表達水平下調(diào)具有時相相關性。因此，我們推測SM22α發(fā)生泛素化可能對VSMC的增殖產(chǎn)生影響。本研究通過轉(zhuǎn)染SM22α及其泛素化突變體，觀察SM22α泛素化修飾對PDGF-BB誘導的VSMC增殖的影響，探討SM22α泛素化修飾的意義及其分子機制

2、。
　　方法與結果:
　　1.PDGF-BB對VSMC細胞增殖活性的影響MTT和細胞計數(shù)分析結果顯示，PDGF-BB刺激12h時，VSMC增殖活性顯著升高，24 h時達到高峰，呈時間依賴性。
　　2.PDGF-BB對SM22α泛素化水平的影響免疫共沉淀結果顯示，PDGF-BB作用于VSMC12 h，SM22α的泛素化水平顯著增高，24 h達高峰，48 h時仍維持在較高水平。該變化與細胞增殖活性增加趨勢相吻合，且具有時相

3、相關性。
　　3.HA-SM22α與泛素化位點突變體的構建與鑒定分別構建HA-SM22α和HA-SM22α泛素化位點突變的融合蛋白表達質(zhì)粒，重組質(zhì)粒經(jīng)PCR擴增、EcoRⅠ/XhoⅠ雙酶切及測序鑒定后，命名為HA-SM22α、 HA-SM22α(K17R)、HA-SM22α(K20R)、HA-SM22α(K21R)、HA-SM22α(K89R)和HA-SM22α(K121R)。
　　4.SM22α泛素化突變體對PDGF-BB

4、誘導的VSMC增殖的影響利用siRNA敲低內(nèi)源性SM22α的表達，分別將SM22α野生型(WT)及泛素化突變體轉(zhuǎn)染VSMC，然后用PDGF-BB刺激24 h。MTT和細胞計數(shù)分析結果表明，野生型HA-SM22α可以抑制PDGF-BB誘導的VSMC增殖，而HA-SM22α(K21R)則增強PDGF-BB的促增殖活性。
　　5.SM22αK21泛素化突變體對PDGF-BB誘導的PCNA表達的影響利用siRNA敲低內(nèi)源性SM22α后，過

5、表達野生型SM22α及K21泛素化突變體SM22α(K21R)，再給予PDGF-BB刺激24 h。Western Blot結果顯示，PDGF-BB可誘導PCNA的表達，轉(zhuǎn)染野生型HA-SM22α顯著抑制PDGF-BB誘導的PCNA表達上調(diào)，而轉(zhuǎn)染HA-SM22α(K21R)則不具有這樣的抑制作用。
　　6.SM22αK21泛素化突變體對PDGF-BB誘導的ERK1/2信號通路的影響利用siRNA敲低內(nèi)源性SM22α，然后過表達野生