神經(jīng)纖毛蛋白-1 siRNA對PDGF-BB刺激肝星狀細胞活化、增殖及遷移的影響.pdf

1、研究背景
　　 經(jīng)過100多年的研究，肝星狀細胞(hepaticstellatecells，HSC)在肝臟病理、生理中的作用已基本證實。HSC的活化是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)。肝纖維化的形成是一個多因素的復(fù)雜過程，不同病因引起纖維化的早期都有HSC的活化，這是纖維化形成的主要細胞基礎(chǔ)。HSC一經(jīng)激活，表型轉(zhuǎn)換形成肌成纖維細胞(myofiroblast，MFB)，分泌大量的細胞外基質(zhì)(extracellularmarix，ECM

2、)，并引起基質(zhì)金屬蛋白酶(MatrixMetalloproteinase，MMPs)和金屬蛋白酶組織抑制物(tissueinhibitorofmetalloproteinase，TIMPs)平衡失調(diào)及抑制HSC凋亡的發(fā)生，活化的肝星狀細胞還能向損傷區(qū)遷移，使損傷區(qū)纖維化，因此肝星狀細胞活化合成大量細胞外基質(zhì)是肝纖維化形成的直接原因，也是肝纖維化發(fā)生的核心環(huán)節(jié)。肝硬化是發(fā)生肝細胞性肝癌(hepatocellularcarcinoma，HC

3、C)的主要危險因素，大部分HCC患者具有慢性肝病、肝硬化的背景。激活的HSC可位于腫瘤基質(zhì)內(nèi)，與腫瘤細胞之間存在密切的相互關(guān)系。近年來研究表明活化的星狀細胞廣泛存在于肝癌的間質(zhì)中，作為腫瘤微環(huán)境的一部分，對肝癌的發(fā)生、發(fā)展及侵襲也起到一定作用。
　　 血小板衍生生長因子(platelet-derivedgrowthfactor，PDGF)是一類由多種細胞分泌產(chǎn)生，具有廣泛的生物學(xué)活性細胞因子，與生長、發(fā)育、癌癥發(fā)生等密切相關(guān)，涉

4、及多種生理及病理過程。PDGF目前被視為HSC最強的促增值因子，能夠強烈刺激HSC激活、增值及遷移，轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞，促使其膠原的產(chǎn)生和沉積，在肝纖維化發(fā)生、發(fā)展中起著非常重要的作用。
　　 神經(jīng)纖毛蛋白-1(Neuropilin-1，NRP-1)是1987年發(fā)現(xiàn)的新型細胞膜表面Ⅰ型跨膜糖蛋白，最初的研究顯示Neuropilin為semaphorin家族受體，可與軸突生長導(dǎo)向因子sema3A結(jié)合，在神經(jīng)發(fā)育時，參與軸突導(dǎo)向、神

5、經(jīng)纖維成束、細胞遷移以及成人神經(jīng)細胞的損傷修復(fù)等重要過程，后來研究結(jié)果顯示NRP-1廣泛表達于內(nèi)皮細胞和腫瘤細胞，可作為VEGF165及與血管新生相關(guān)的其它幾種VEGF家族成員的受體。目前研究表明NRP-1廣泛存在人體組織中，對某些疾病的發(fā)生、發(fā)展起著重要的作用。關(guān)于NRP-1的研究也已從最初神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育擴展至血管形成、腫瘤發(fā)生與發(fā)展、造血系統(tǒng)疾病、消化系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)功能等多領(lǐng)域，尤其是其在腫瘤及血管生成方面的研究逐漸成為熱點。

6、r>　　 近年來不斷有研究證實NRP-1可增強PDGF對細胞的作用，并認(rèn)為NRP-1可能為PDGF的協(xié)同受體或共受體。部分學(xué)者在人肝硬化及小鼠肝硬化模型標(biāo)本中活化的星狀細胞上，發(fā)現(xiàn)高表達的NRP-1，并與血小板衍生生長因子受體-ββ(platelet-derivedgrowthfactorreceptor，PDGFR-ββ)表達有相關(guān)性。也有研究發(fā)現(xiàn)NRP-1表達在肝周內(nèi)皮細胞，肝癌細胞，但在正常的肝細胞沒有表達NRP-1。這些資料表

7、明NRP-1在肝臟的疾病中有著重要作用。
　　 RNA干擾(RNAinterference，RNAi)現(xiàn)象是指當(dāng)與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)某段序列同源的雙鏈RNA(dsRNA)被導(dǎo)入細胞后，可導(dǎo)致該內(nèi)源性mRNA發(fā)生特異性的降解，從而導(dǎo)致該基因表達的沉寂，產(chǎn)生相應(yīng)的功能缺失，是一種在轉(zhuǎn)錄后使基因表達的沉默的現(xiàn)象(post-transcriptionalgenesilencing，PTGS)。目前該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)實驗。

8、　　 目前國外關(guān)于NRP-1對肝臟疾病作用的研究還非常少見，國內(nèi)尚未見相關(guān)文獻報道。本研究利用RNA干擾方法抑制NRP-1表達后，觀察PDGF-BB對肝星狀細胞的作用，為進一步探索NRP-1對肝臟的病理、生理研究做好鋪墊。
　　 目的:
　　 觀察siRNA抑制NRP-1后對PDGF-BB刺激肝星狀細胞活化、增殖及遷移作用的影響。為探索NRP-1在肝硬化、肝癌的作用提供理論基礎(chǔ)以及為肝硬化、肝癌的治療提供新的靶點。

9、r>　　 方法:
　　 1.采用免疫熒光雙重染色方法檢測NRP-1及PDGFR-ββ在肝星狀細胞LX2的表達。
　　 2.將化學(xué)合成針對NRP-1的siRNA及陰性對照siRNA轉(zhuǎn)染至LX2內(nèi)，將細胞分為陽性干擾組（A組）、陰性干擾組（B組）、正常對照組（C組），實時熒光定量PCR檢測各組不同時段NRP-1mRNA的表達及West-blot檢測各組不同時段NRP-1蛋白的表達。
　　 3.于轉(zhuǎn)染24小時后向A組

10、、B組、C組加入PDGF-BB（終濃度為20ng/ml）孵育細胞，然后進行如下操作:
　　 (1)24小時后逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測三組細胞α-SMAmRNA的表達。
　　 (2)12小時后用CCK8法檢測LX2的增殖情況。
　　 (3)劃痕實驗檢測LX2的遷移能力。
　　 4.統(tǒng)計學(xué)方法
　　 本課題采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理和分析，計量資料以均數(shù)(±)標(biāo)準(zhǔn)差（(x)(±)s）

11、表示。多組均數(shù)比較采用單因素方差分析(One--WayANOVA)，若方差齊性取F值，若方差不齊則采用Welch法，組間比較在方差齊性時采用Bonferroni檢驗，方差不齊時采用DunnettT3法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.免疫熒光雙重染色顯示NRP-1及PDGFR-ββ共同在LX2細胞膜上廣泛表達。
　　 2.實時熒光定量PCR提示A組轉(zhuǎn)染siRNA后24小時、48小時的NR

12、P-1mRNA表達量較B組相同時間段的表達量及C組的表達量明顯下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)，B、C組間無顯著差異(P=0.120，P=1.000)。轉(zhuǎn)染72小時后，A組NRP-1mRNA表達量逐漸恢復(fù)，與B、C三組間均未見顯著差異(F=0.800，P=0.492)。
　　 3.West-blot結(jié)果顯示A組轉(zhuǎn)染siRNA后24小時、48小時的NRP-1蛋白的相對表達量較B組相同時間段的表達量及C組的表達量明顯下降，

13、差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)，B、C組間無顯著差異(P=1.000，P-1.000)。轉(zhuǎn)染72小時后，A組NRP-1蛋白的相對表達量逐漸恢復(fù)，與B、C三組間均未見顯著差異(F=0.303，P=0.750)。
　　 4.RT-PCR檢測加入PDGF-BB24h后三組細胞的α-SMAmRNA的表達有差異(F=33.492，P=0.001)。與B組及C組相比，A組mRNA的表達值顯著下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001，P=

14、0.001)。B組及C組之間mRNA的表達值并無顯著差異(P=1.000)。
　　 5.CCK8法檢測三組OD值經(jīng)方差齊性檢驗P=0.039，說明方差不齊，用近似F檢驗的Welch法檢驗P=0.007，采用DunnettT3法行組間比較，結(jié)果顯示:與B組及C組相比，A組OD值顯著下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.019，P=0.019);B組及C組之間OD值并無顯著差異(P=0.982)。說明A組細胞增殖明顯受到抑制。
　

15、　 6.細胞劃痕實驗結(jié)果顯示，加入PDGF-BB48h后，A組細胞遷移率為(67.83±2.44)％，B組及C組細胞遷移率為(89.26±0.30)％、(88.46±1.98)％，單因素方差分析結(jié)果表明三組細胞數(shù)有統(tǒng)計學(xué)差異(F=132.732，P=0.000)，組間Bonferroni法檢驗結(jié)果表明A組細胞遷移能力與B組及C組細胞明顯減弱，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000，P=0.000)。B組及C組細胞之間比較無顯著區(qū)別(P=1.