敲低HIF-1α基因?qū)σ胰┐碳さ母涡菭罴?xì)胞增殖活化影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）是因過量攝入酒精引發(fā)的中毒性肝臟病變，早期通常表現(xiàn)為酒精性脂肪肝（alcoholic fatty liver disease，AFLD）可進(jìn)展為酒精性肝炎、酒精性肝纖維化(alcohol liver fibrosis，ALF）、肝硬化、甚至肝癌。ALF病因明確，但其發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚。目前認(rèn)為肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，

2、HSCs）增殖與活化是肝纖維化發(fā)生的核心環(huán)節(jié)。近十多年來國內(nèi)外研究表明，缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1）作為低氧應(yīng)答調(diào)控的管家基因，可能通過其調(diào)節(jié)的靶基因參與HSCs的活化與增殖。HIF-1是由調(diào)節(jié)亞基HIF-1α與結(jié)構(gòu)性亞基HIF-1β共同組成的異源二聚體，HIF-1α對HIF-1發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子活性起著至關(guān)重要的影響，在細(xì)胞內(nèi)水平受到氧依賴和非氧依賴信號事件的調(diào)控。有研究者用內(nèi)毒素培育

3、人肝星狀細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)HIF-1α高表達(dá)，且標(biāo)志HSCs活化的I型膠原蛋白（Collagen I）、α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）高表達(dá)，抑制HIF-1α表達(dá)后，I型膠原蛋白及α-SMA表達(dá)也隨之減低。我們前期在酒精灌胃構(gòu)建的大鼠ALD模型中觀察到：隨著造模時間的延長，肝組織HIF-1α mRNA和蛋白表達(dá)隨之增多，提示HIF-1α可能參與著ALD發(fā)病過程。本研究選用200μmol/L乙醛刺激

4、大鼠HSC-T6細(xì)胞，特異性抑制HIF-1α表達(dá)，觀察HSC-T6細(xì)胞增殖情況及α-SMA和Collagen I表達(dá)變化。旨在細(xì)胞水平闡明抑制HIF-1α表達(dá)對HSC-T6細(xì)胞增殖及α-SMA和Collagen I表達(dá)影響，探討HIF-1α調(diào)控的HSCs在ALF中的作用。
　　方法：
　　復(fù)蘇HSC-T6細(xì)胞用含10％胎牛血清、1%青鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基在5% CO2，37℃條件下培養(yǎng)到對數(shù)生長期。實(shí)驗(yàn)分為正常對照組（

5、常規(guī)培養(yǎng)）、乙醛刺激組（終濃度為200μmol/L）、HIF-1αsiRNA組（siRNA100nm/L+乙醛終濃度為200μmol/L）、HIF-1αsiRNA陰性對照（negative control, NC）組（NC siRNA+乙醛終濃度為200μmol/L）。利用200μmol/L乙醛刺激大鼠HSC-T6細(xì)胞，將HIF-1αsiRNA、NC siRNA通過脂質(zhì)體LipofectamineTM2000瞬時轉(zhuǎn)染至HSC-T6細(xì)胞，

6、培養(yǎng)6h后，更換為新鮮完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48h，應(yīng)用CCK-8檢測大鼠HSC-T6細(xì)胞增殖變化；收集細(xì)胞，分別利用RT-qPCR和Western blot法檢測HIF-1α、α-SMA和Collagen I mRNA和蛋白表達(dá)水平；用4%多聚甲醛固定，行免疫熒光染色，觀察α-SMA蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1轉(zhuǎn)染HIF-1αsiRNA敲低HIF-1α基因?qū)Υ笫驢SC-T6細(xì)胞增殖的影響
　　瞬時轉(zhuǎn)染HIF-1αs

7、iRNA48h后，細(xì)胞增長情況明顯減慢，CCK-8比色結(jié)果：與正常對照組比較，乙醛刺激組OD值明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），提示200μmol/L乙醛可明顯促進(jìn) HSC-T6細(xì)胞增殖；HIF-1αsiRNA組OD值與乙醛刺激組比較，細(xì)胞增長情況明顯減慢，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；HIF-1αsiRNA NC組與乙醛刺激組比較， OD值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P均>0.05）。
　　2采用 RT-qPCR法檢測

8、 HIF-1α、α-SMA和 CollagenⅠ基因相對于β-action內(nèi)參基因表達(dá)變化：正常對照組HSC-T6細(xì)胞中HIF-1α、α-SMA和 CollagenⅠ的表達(dá)均較少；乙醛刺激組與正常對照組比較，HIF-1α、α-SMA和CollagenⅠ表達(dá)量明顯增多（P均<0.01）；敲低HIF-1α基因， HIF-1α siRNA組與乙醛刺激組比較，HIF-1α表達(dá)降低的同時α-SMA和CollagenⅠ表達(dá)明顯減少（P均<0.01）

9、；HIF-1αsiRNA NC組和乙醛刺激組比較，各個指標(biāo)表達(dá)的變化，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均>0.05）。
　　3通過 Western blot法檢測 HIF-1αsiRNA轉(zhuǎn)染后 HSC-T6細(xì)胞中的HIF-1α、α-SMA和CollagenⅠ蛋白水平表達(dá)變化：乙醛刺激組HIF-1α、α-SMA和CollagenⅠ蛋白表達(dá)量明顯增多，乙醛刺激組與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均<0.01）；轉(zhuǎn)染HIF-1αsiRNA48h

10、后，HIF-1α蛋白表達(dá)降低，與乙醛刺激組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），且α-SMA和CollagenⅠ蛋白的表達(dá)量也減低；HIF-1αsiRNA NC組與乙醛刺激組比較，各個指標(biāo)表達(dá)變化，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均>0.05）。
　　4免疫熒光染色法觀察大鼠HSC-T6細(xì)胞中α-SMA蛋白表達(dá)情況：可觀察到正常對照組細(xì)胞表達(dá)少量α-SMA；乙醛刺激組細(xì)胞α-SMA蛋白表達(dá)增多；轉(zhuǎn)染HIF-1αsiRNA48h后，細(xì)胞中的