α-干擾素對活化的肝星狀細胞早期凋亡的影響.pdf

1、目的：肝纖維化(liver fibrosis)是各種慢性肝病產(chǎn)生的一種病理過程，可視為肝硬變的早期階段。在我國慢性乙型肝炎是引起肝纖維化及肝硬化的主要原因。α-干擾素(interferon α，IFN-α)作為治療病毒性肝炎的抗病毒藥物應用于臨床的同時，近年來一些學者研究發(fā)現(xiàn)α-干擾素還具有一定的不依賴于抗病毒作用而獨立存在的抗肝纖維化的作用，但對其抗肝纖維化的作用機制仍不十分清楚。目前已有研究表明IFN-α有促進肝星狀細胞(Hepat

2、ic stellate cell,HSC)凋亡的作用，但對其作用于凋亡的何階段未見報道。本研究運用四甲基偶氮唑藍實驗(methyl thiazolyltetrazolium,MTT)及應用流式細胞儀(flow cytometry)AnnexinV和PI雙染方法研究在外源性α-干擾素的刺激下，體外培養(yǎng)的活化的大鼠HSC早期凋亡的情況，進一步認識α-干擾素抗肝纖維化的作用機制，為臨床應用提供理論依據(jù)。 材料與方法: 在本研究

3、中，我們對活化的大鼠HSC進行體外培養(yǎng)，然后分別選取生長狀態(tài)良好的不同的三代細胞，接種在96孔板中后，用含．IFN-α濃度分別為0、1×10<'2>、1×10<'3>、1×10<'4>、1×10<'5> U/ml的DMEM培養(yǎng)液與活化的大鼠HSC共同培養(yǎng)24小時后，向各孔加入MTT液50ul繼續(xù)培養(yǎng)4小時后，棄上清液，加入二甲基亞砜(DMSO)100ul，震蕩10min，上酶標儀于492nm波長處測吸光度值，代表各孔的細胞數(shù)。

4、再選取生長狀態(tài)良好的不同的三代細胞，分別加入含有與上述相同濃度的IFN-α的DMEM培養(yǎng)液與活化的大鼠HSC共同培養(yǎng)24小時后，取lml細胞，1000rpm 4。C離心10分鐘，棄上清。加入lml冷的PBS，輕輕震蕩使細胞懸浮，1000rpm．4℃離心10分鐘，棄上清。將細胞懸于200ul Binding Buffer，加入10ulAnnexinV-FITC和5ul PI，輕輕混勻，避光室溫反應15分鐘，加入300ul BindingB

5、uffer，在1小時內應用美國BD公司流式細胞儀進行檢測。應用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件對以上結果進行t檢驗。 實驗結果: α-干擾素對活化的大鼠HSC凋亡影響的研究。 1．MTT法測定結果：用含IFN-α濃度分別為0.1×10<'2>、1×10<'3>、1×10<'4>、1×10<'5>U/ml的DMEM培養(yǎng)液與活化的大鼠HSC共同培養(yǎng)24小時后，測得各組的OD值分別為0.493±0.0518、0.4497±0

6、.0338、0.4273±0.0566、0.3657±0.0581和0.2707±0.0387。以上結果可以看出，經(jīng)IFN-α刺激后，活化的大鼠HSC的活細胞數(shù)隨IFN-α的濃度增加而減少。經(jīng)SPSS軟件進行t檢驗統(tǒng)計學分析，1×10<'4>、1×10<'5>U/ml的IFN-α組與對照組比較有顯著性差異，分別為t=2.82和t=5.44>t<,0.05/2(4)>=2.132，P<0.05有統(tǒng)計學意義。而其他兩組與對照組比較無顯著差異

7、。說明IFN-α在濃度為1×10<,'4>、1×10<'5>U/ml時可使活化的大鼠HSC的數(shù)目減少，表明IFN-α可能有誘導活化的大鼠HSC凋亡的作用。 2．流式細胞儀檢測結果：用0、1×10<'2>、1×10<'3>、1×10<'4>及1×10<'5>U/ml作用濃度組的IFN-α作用于體外培養(yǎng)的活化的HSC后，經(jīng)Annexin V和PI雙染上流式細胞儀檢測結果IFN-α作用組的右下象限中的紅色標記點比對照組的右下象限中紅色

8、標記點明顯增多，并且1×10<'4>及1×10<,'5>U/ml早期凋亡率分別為0.0553±0.008921、0.0915±0.0200。經(jīng)SPSS軟件進行統(tǒng)計學分析，1×10<'4>及1×10<'5>U/ml兩個作用濃度組的早期凋亡率與對照組比較有顯著性差異，分別為t=4.31和t=5.07>t<,0.05/2(4)>，P<0.05有統(tǒng)計學意義。說明IFN-α主要誘導活化的大鼠HSC的早期凋亡。 結論: 1．IFN-