腺病毒介導(dǎo)的shRNA阻斷PTEN表達(dá)對(duì)體外活化肝星狀細(xì)胞增殖與凋亡的影響.pdf

1、肝纖維化(HF)是各種慢性肝病向肝硬化乃至肝癌發(fā)展的必經(jīng)途徑和必然階段，肝星狀細(xì)胞(HSCs)是肝臟中細(xì)胞外間質(zhì)(ECM)的主要來(lái)源，在各種刺激因素作用下，其激活并轉(zhuǎn)化為肌成纖維樣細(xì)胞，進(jìn)而合成大量的膠原等ECM成分，是肝纖維化發(fā)生發(fā)展過(guò)程的中心環(huán)節(jié)。因此，如何抑制HSCs活化、增殖并促進(jìn)其凋亡是逆轉(zhuǎn)肝纖維化的關(guān)鍵所在。
　　 第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶張力蛋白同源物基因(PTEN)是迄今為止發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)具有磷酸酶活性的腫瘤抑制

2、基因，可抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡，其缺失或表達(dá)異常與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。
　　 近年來(lái)，對(duì)PTEN的研究在腫瘤領(lǐng)域已經(jīng)取得了重大進(jìn)展，且己逐漸延伸至非腫瘤領(lǐng)域。有研究發(fā)現(xiàn)PTEN蛋白表達(dá)異常或活性的改變?cè)谄鞴倮w維化過(guò)程中發(fā)揮重要作用。而我們的前期研究表明，在膽總管結(jié)扎致肝纖維化大鼠肝組織中PTEN蛋白及mRNA的表達(dá)均低于其在正常大鼠肝組織中的表達(dá)，并與在體HSCs的活化、增殖呈顯著負(fù)相關(guān)，且PTEN過(guò)表達(dá)可顯著抑制

3、體外活化HSCs的增殖并誘導(dǎo)其凋亡。但阻斷PTEN表達(dá)對(duì)體外活化HSC增殖、凋亡的影響及相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制仍不清楚。
　　 RNA干擾（RNAi）是目前最有效的基因沉默技術(shù)，可以特異性抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而下調(diào)相應(yīng)的蛋白水平及功能。為此，在前期研究的基礎(chǔ)上，以腺病毒為載體，構(gòu)建了靶向PTEN的短發(fā)卡RNA（shRNA）干擾重組體，應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，在體外感染活化大鼠肝星狀細(xì)胞系HSC-T6，構(gòu)建了HSCs的PTEN低表達(dá)模型，觀察阻

4、斷PTEN表達(dá)對(duì)活化HSCs增殖、凋亡的影響，從反面探討PTEN在調(diào)控HSCs生物學(xué)行為中的作用，以期從正反兩面揭示PTEN調(diào)控HSCs增殖、凋亡的可能性及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，從而為尋求治療肝纖維化的有效新靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。
　　 目的：觀察阻斷PTEN表達(dá)對(duì)體外活化HSCs增殖與凋亡的影響及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。
　　 方法：利用AD293T細(xì)胞擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)所需要的重組腺病毒(Ad-EGFP、PTEN shRNA)，并在熒光

5、顯微鏡下檢測(cè)病毒滴度，進(jìn)一步感染體外活化的大鼠肝星狀細(xì)胞系HSC-T6。實(shí)驗(yàn)分組如下：①Control組，以含10％胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染步驟加入無(wú)血清無(wú)抗生素的DMEM代替病毒液；②Ad-EGFP組，轉(zhuǎn)染表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)的空病毒Ad-EGFP;③PTENshRNA組，轉(zhuǎn)染靶向PTEN的RNA干擾序列并表達(dá)EGFP的重組腺病毒PTEN shRNA。
　　 采用直接細(xì)胞計(jì)數(shù)法繪制HSCs生長(zhǎng)

6、曲線，MTT法測(cè)定HSCs增殖；末段脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的脫氧三磷酸尿苷缺口末段標(biāo)記(TUNEL)法、流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)HSCs凋亡；采用Western blot技術(shù)檢測(cè)PTEN、Bax、Bcl-2、Akt、p-Akt、ERK1及p-ERK1、蛋白表達(dá)情況；real-timeQ-PCR方法檢測(cè)PTEN、Akt及ERK1mRNA的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：
　　 ①通過(guò)反復(fù)感染AD293T細(xì)胞使病毒擴(kuò)增，從而獲得了實(shí)驗(yàn)

7、所需要的病毒液(Ad-EGFP、PTENshRNA的滴度分別為1.2×109pfu/mL、1.1×109pfu/mL);
　　 ②應(yīng)用real-timeQ-PCR檢測(cè)腺病毒感染HSCs后72h活化HSC的PTENmRNA表達(dá)，并采用2-△△Ct相對(duì)定量法比較各組HSC中PTENmRNA表達(dá)的差異，以Control組為對(duì)照組，則Ad-EGFP組、PTENshRNA組較Control組的PTENmRNA的相對(duì)倍數(shù)為0.93倍和0.6

8、3倍。其中PTENshRNA組PTENmRNA表達(dá)明顯低于Control組及Ad-EGFP組；而Ad-EGFP組與Control組之間無(wú)顯著性差異。進(jìn)一步應(yīng)用Westernblot法檢測(cè)分析PTEN蛋白在各組細(xì)胞中的表達(dá)，PTENshRNA組(1.11±0.03)顯著低于Control組(1.49±0.04)及Ad-EGFP組(1.48±0.02)；而Ad-EGFP組與Control組之間無(wú)顯著性差異?？梢宰C明PTENshRNA已成功轉(zhuǎn)

9、染體外活化的HSC;
　　 ③細(xì)胞生長(zhǎng)曲線結(jié)果顯示：腺病毒轉(zhuǎn)染24h時(shí)，三組之間無(wú)明顯差別，轉(zhuǎn)染48h、72h后，與Control組相比，PTENshRNA組可以促進(jìn)HSCs生長(zhǎng)，并隨時(shí)間延長(zhǎng)其增殖率逐漸升高，于72h達(dá)最高，較Control組升高了22.5％;Ad-EGFP組的增殖率在各時(shí)間點(diǎn)與Control組無(wú)明顯差別；
　　 ④MTT檢測(cè)結(jié)果顯示：腺病毒感染活化HSCs后24h，Ad-EGFP及PTENshRNA對(duì)

10、細(xì)胞增殖均無(wú)明顯作用。而在48h、72h時(shí)PTENshRNA可刺激HSCs增殖，其增殖率分別為29.51％、43.29％(以Control組為對(duì)照)。在48h、72h時(shí)Ad-EGFP組與Control組A值比較無(wú)顯著性差異;
　　 ⑤TUNEL法檢測(cè)結(jié)果顯示，腺病毒感染HSCs后72h，PTENshRNA組HSCs凋亡率為2.94％±0.31％，低于Control組(5.17％±0.27％)及Ad-EGFP組(5.34％±0.4

11、3％);而Ad-EGFP組與Control組之間無(wú)顯著性差異；
　　 ⑥PI標(biāo)記的流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)結(jié)果顯示，PTENshRNA組HSCs凋亡率（1.26％±0.18％）低于Control組（3.28％±0.42％）及Ad-EGFP組（2.95％±0.41％）;Ad-EGFP組與Control組比較無(wú)顯著性差異；
　　 ⑦應(yīng)用Westemblot技術(shù)檢測(cè)腺病毒感染HSCs后72h時(shí)Bax蛋白在各組細(xì)胞中的表達(dá)，其結(jié)果顯示：

12、PTENshRNA組(0.98±0.04)顯著低于Control組(1.29±0.03)及Ad-EGFP組(1.30±0.04)，而Control組與Ad-EGFP組之間無(wú)顯著性差異。同時(shí)對(duì)各組HSCs中Bcl-2蛋白表達(dá)的檢測(cè)顯示，PTENshRNA組(1.46±0.06)較Control組(1.08±0.04)及Ad-EGFP組(1.07±0.05)顯著升高，而Control組與Ad-EGFP組之間無(wú)顯著性差異；
　　 ⑧應(yīng)

13、用Westernblot和real-timeQ-PCR方法檢測(cè)腺病毒感染HSCs后72h各組HSCs中的Akt蛋白及其mRNA表達(dá)，其結(jié)果顯示各組HSCs中的Akt蛋白和mRNA表達(dá)均無(wú)顯著性差異；而應(yīng)用Westernblot對(duì)HSCs中p-Akt(Thr308)蛋白表達(dá)的研究顯示，PTENshRNA組(1.59±0.03)顯著高于Control組(1.21±0.03)及Ad-EGFP組(1.16±0.04)，Control組及Ad-E

14、GFP組之間無(wú)顯著性差異；
　　 ⑨應(yīng)用Westernblot和real-timeQ-PCR方法檢測(cè)腺病毒感染HSCs后72h各組HSCs中的ERKi蛋白及其mRNA的表達(dá)，其結(jié)果顯示各組HSCERKi蛋白及其mRNA表達(dá)均無(wú)顯著性差異，而應(yīng)用Westernblot技術(shù)對(duì)HSCs中p-ERKi蛋白表達(dá)的研究顯示，PTENshRNA組(1.20±0.024)顯著高于Control組(0.73±0.05)和Ad-EGFP組(0.81