腺病毒介導(dǎo)的shRNA下調(diào)PTEN表達(dá)對體外活化肝星狀細(xì)胞粘附與遷移的影響.pdf

1、目的：探討腺病毒介導(dǎo)的shRNA下調(diào)第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶張力蛋白同源物基因（phosphatase and tensin homology deleted on chromosome Ten, PTEN）表達(dá)對體外培養(yǎng)的活化肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells, HSC）粘附與遷移的影響及其可能的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。
　　方法:利用 AD293細(xì)胞反復(fù)的被腺病毒感染的方法擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)所需的腺病毒（Ad-GFP、Ad

2、-shRNA/PTEN），并且測定兩組病毒滴度；體外培養(yǎng)活化大鼠 HSC系（HSC-T6），以腺病毒為載體將靶向PTEN的shRNA干擾重組體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至活化HSC；采用 Western blot方法檢測 HSC的 PTEN、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1（extracellular signal-regulated kinase1, ERK1）、磷酸化 ERK1（phosphorylated ERK1, p-ERK1）蛋白表達(dá)；采用四甲基偶氮唑鹽

3、（MTT）比色法與甲苯胺藍(lán)染色法測定HSC的粘附能力；采用劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)測定HSC的平面遷移能力、Transwell小室測定HSC的跨膜遷移能力。所有資料應(yīng)用Excel2010建立數(shù)據(jù)庫，應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較應(yīng)用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間比較應(yīng)用 LSD檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)分組如下：（1）Control組：在轉(zhuǎn)染病毒步驟加入無

4、血清無抗生素的DMEM代替病毒液；（2）Ad-GFP組：在轉(zhuǎn)染步驟加入只表達(dá)綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的空病毒；（3） Ad-shRNA/PTEN組：轉(zhuǎn)染靶向PTEN的shRNA干擾序列并同時(shí)表達(dá)GFP的重組腺病毒。
　　結(jié)果:1、通過反復(fù)感染 AD293細(xì)胞的方法獲得實(shí)驗(yàn)所需腺病毒液Ad-GFP、Ad-shRNA/PTEN，其滴度分別為：1.3×109pfu/mL、1.5×109p

5、fu/mL。2、感染倍數(shù)（Multiplicity of infection, M.O.I.）20時(shí)，腺病毒感染HSC后48h，計(jì)數(shù)GFP熒光陽性的表達(dá)細(xì)胞，測的Ad-GFP、Ad-shRNA/PTEN組腺病毒轉(zhuǎn)染率均＞80％。3、腺病毒轉(zhuǎn)染后48h，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測各組HSC的PTEN mRNA表達(dá)，并采用2-△△Ct相對定量法比較，其中以 Control組 PTEN基因表達(dá)量為1，Ad-GFP組、Ad-shRNA/PTEN組較

6、 Control組的 PTEN mRNA的相對表達(dá)量分別為0.92倍和0.64倍，Ad-shRNA/PTEN組PTEN mRNA表達(dá)明顯低于Control組及Ad-GFP組（P<0.05）；Control組與 Ad-GFP組 PTEN mRNA表達(dá)無明顯差異（P>0.05）。應(yīng)用 Western blot技術(shù)檢測各組 HSC的 PTEN蛋白表達(dá)顯示：Ad-shRNA/PTEN組（1.088±0.036）顯著低于 Control組（1.4

7、38±0.038）及 Ad-GFP（1.413±0.058），P<0.05；Control組與 Ad-GFP組之間無明顯性差異（P>0.05）。4、甲苯胺藍(lán)染色法檢測HSC粘附能力：腺病毒感染HSC48 h，與Control組粘附的細(xì)胞數(shù)（495.00±13.23）、Ad-GFP組粘附細(xì)胞數(shù)（500.00±18.03）相比，Ad-shRNA/PTEN組粘附細(xì)胞數(shù)（592.00±12.53）明顯增多（P<0.05）；而Ad-GFP組與Co

8、ntrol組之間粘附細(xì)胞數(shù)無明顯差異（P>0.05）。5、MTT比色法測定 HSC粘附能力：腺病毒感染 HSC48 h，與 Control組的吸光度（Absorbance, A）值（0.279±0.015）相比，Ad-GFP組A值（0.285±0.011），兩組間A值無明顯差異（P>0.05），Ad-GFP組HSC粘附率為102.67±8.29%；Ad-shRNA/PTEN組A值（0.335±0.013），較Control組及Ad-GF

9、P組明顯增高（P<0.05），Ad-shRNA/PTEN組 HSC粘附率為120.34±7.26%。6、劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)顯示：劃痕后12 h各組 HSC均向中間有所遷移，但遷移距離經(jīng)計(jì)算無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；劃痕后24 h HSC向中間遷移的距離， Control組（207.78±3.24μm）、Ad-shRNA/PTEN組（225.00±4.48μm）、Ad-GFP組(207.95±3.54μm)， Ad-shRNA/PTEN組與

10、Ad-GFP組及Control組相比有顯著差異（P<0.05），Ad-GFP組與 Control組相比無顯著差異（P>0.05）；劃痕后48 h HSC向中間遷移的距離，Control組（284.33±2.52μm）、Ad-shRNA/PTEN組（312.87±2.25μm）、Ad-GFP組（281.98±4.34μm），Ad-shRNA/PTEN組與Control組及Ad-GFP組相比有顯著性差異（P<0.05），Control組及

11、Ad-GFP組無差異（P>0.05）。7 Transwell小室檢測 HSC跨膜遷移結(jié)果示：Ad-shRNA/PTEN組跨膜細(xì)胞數(shù)（101.67±3.06）較Ad-GFP組跨膜細(xì)胞數(shù)（67.67±1.53）及Control組跨膜細(xì)胞數(shù)（69.33±2.52）顯著增多（P<0.05），Control組與 Ad-GFP組之間無明顯差異（P>0.05）。8應(yīng)用 Western blot和實(shí)時(shí)熒光定量 PCR方法檢測腺病毒感染HSC48 h后各

12、組HSC ERK1蛋白及其mRNA表達(dá)，其結(jié)果表明各組ERK1蛋白及其mRNA表達(dá)均無明顯變化（P>0.05)；應(yīng)用 Western blot檢測各組p-ERK1蛋白表達(dá)，Ad-shRNA/PTEN組（1.067±0.047）、Control組（0.710±0.023）及 Ad-GFP組（0.692±0.037），Ad-shRNA/PTEN組較Control組及Ad-GFP組表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而Contro