下調(diào)ubc9對人肝星狀細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、背景:
　　肝纖維化(hepatic fibrosis, HF)是肝臟對不同病因所致的慢性肝臟疾病的病理學(xué)綜合征,是各種慢性肝病發(fā)展的必經(jīng)階段。在整個肝纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中,肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells, HSCs)的激活是一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)?；罨腍SCs能過量表達(dá)α-平滑肌肌動蛋白(Alpha smooth muscle actin,α-SMA)并合成異常增多的細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular C

2、ell Matrix,ECM)超過肝臟的代謝能力從而導(dǎo)致其在肝內(nèi)大量聚集。HSCs活化的初始階段主要是由鄰近細(xì)胞(如肝細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞等)通過旁分泌作用啟動的。此外,HSCs還可分泌一些細(xì)胞因子促進(jìn)Kupffer細(xì)胞激活以及通過自分泌或者旁分泌促進(jìn)自身進(jìn)一步激活。
　　小泛素樣分子相關(guān)修飾物(small ubiquitin-like modifier, SUMO)是一種類泛素樣蛋白,與泛素(ubiquitin)泛素介導(dǎo)的蛋

3、白降解途徑不同,SUMO化的結(jié)果并不是將靶蛋白降解,而是通過修飾來增強(qiáng)它們的穩(wěn)定性或者調(diào)節(jié)其亞細(xì)胞定位及影響其轉(zhuǎn)錄活性,從而發(fā)揮更加廣泛的作用。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)隨著肝纖維化的進(jìn)展,SUMO-1的表達(dá)量逐漸增加。SUMO-1可能通過增強(qiáng)TGF-β1及PDGF的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)HSC的增殖和活化,促進(jìn)其分泌膠原,表現(xiàn)出促肝纖維化作用。SUMO化修飾過程需要多種酶參與,但只有唯一的接合酶-ubc9。因此,我們推斷ubc9可能通過調(diào)節(jié)SUMO化

4、參與肝纖維化甚至肝癌的發(fā)生發(fā)展。為進(jìn)一步研究ubc9在肝纖維化過程中的作用及其機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)首先利用RT-PCR和Western blot檢測正常肝細(xì)胞株L02、人源性肝星狀細(xì)胞株LX-2和肝癌細(xì)胞HepG2、SMMC-7721內(nèi)ubc9的表達(dá)量。再將pcDNA6.2-mir ubc9瞬時轉(zhuǎn)染LX-2,以Western blot方法檢測轉(zhuǎn)染前后LX-2細(xì)胞內(nèi)ubc9、α-SMA、IKBα、p65及Bcl-2等基因的表達(dá)情況,以ELISA分

5、析轉(zhuǎn)染前后LX-2細(xì)胞分泌TNF-α與IL-6的變化,以流式細(xì)胞術(shù)分析轉(zhuǎn)染前后LX-2細(xì)胞凋亡與周期的變化情況。以期闡明ubc9在肝纖維化中的作用機(jī)制。
　　目的:
　　探討ubc9在LX-2細(xì)胞活化與增殖過程中的作用及其機(jī)制
　　方法:
　　分別在體外培養(yǎng)正常肝細(xì)胞株L02、肝星狀細(xì)胞株LX-2和肝癌細(xì)胞HepG2、SMMC-7721后提取RNA及蛋白質(zhì),再利用RT-PCR及western blot檢測ubc9

6、的表達(dá)水平;將人工合成的針對ubc9基因的pcDNA6.2-mir ubc9質(zhì)粒轉(zhuǎn)染LX-2,采用RT-PCR及western blot方法檢測轉(zhuǎn)染后LX-2中ubc9的表達(dá)變化,以western blot方法檢測轉(zhuǎn)染后LX-2中α-SMA、IKBα、p65及Bcl-2的表達(dá)變化,以ELISA分析轉(zhuǎn)染前后LX-2細(xì)胞分泌TNF-α與IL-6的變化,以流式方法檢測各實(shí)驗(yàn)組LX-2細(xì)胞的周期及凋亡。
　　結(jié)果:
　　RT-PCR

7、與Western blot檢測發(fā)現(xiàn)正常肝細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞和肝癌細(xì)胞內(nèi)均會表達(dá)ubc9基因;人工合成的針對ubc9基因的pcDNA6.2-mir ubc9質(zhì)粒能抑制LX-2細(xì)胞中ubc9、α-SMA、p65及Bcl-2基因的表達(dá),同時能增加IKBα的表達(dá),與對照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。轉(zhuǎn)染后LX-2的周期被阻滯在G2/M期,并且能夠促進(jìn)LX-2的凋亡,與對照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。以上結(jié)果說明,下調(diào)ub