草蓯蓉對大鼠肝星狀細胞增殖與凋亡的影響及其分子機制的研究.pdf

1、肝纖維化是各種慢性肝病導(dǎo)致肝硬化的共同病理基礎(chǔ)和必經(jīng)之路，是對慢性損傷的修復(fù)反應(yīng)。肝纖維化以細胞外基質(zhì)的大量產(chǎn)生特別是Ⅰ型膠原的異常沉積為主要特征。其中肝星狀細胞（hepatic stellate cell,HSC）是細胞外基質(zhì)的主要來源，在正常肝臟組織中數(shù)目很少，為肝內(nèi)膠原合成的主要細胞，它在肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用。HSC的激活和增殖促進肝纖維化，抑制HSC的增殖、誘導(dǎo)其凋亡可減輕甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化。所以近年來，抑制肝

2、星狀細胞的增殖以及誘導(dǎo)其凋亡已經(jīng)成為研究、治療肝纖維化的重點課題。而肝星狀細胞（hepatic stellate cell,HSC）的激活、增殖和凋亡機制非常復(fù)雜，涉及許多細胞因子、調(diào)節(jié)蛋白、及各種信號通路，HSC的激活和增殖涉及的主要的細胞因子主要有腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、胰島素生長因子（IGF-1）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）、肝細胞生長因子（HGF）以及血小板源性生長因子又稱血小板衍化生長因子（PDGF）等，調(diào)節(jié)HSC

3、凋亡的主要有Bcl-2家族、caspase家族等通過各種凋亡信號途徑引起細胞凋亡。PDGF是目前已知的最強的促HSC增殖因子，而活化的HSC分泌大量的PDGF，通過激活有絲分裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路，下調(diào)p27的表達而促進HSC進入S期，使HSC持續(xù)活化和增殖，導(dǎo)致HSC明顯增殖。在肝纖維化的過程中，PDGF可通過系列信號傳導(dǎo)激活A(yù)kt/p70S6k信號通路，通過阻斷Akt/p70S6k信號通路可達到抑制HSC的增殖、促進其

4、凋亡并減少Ⅰ型膠原的表達的效果。
　　草蓯蓉為長白山區(qū)特有的天然要用植物，具有抗自由基、抗脂質(zhì)過氧化、抗腫瘤、抗炎等作用，先期研究已證實，草蓯蓉乙醇提取物有抗肝纖維化的作用。樸虎林等通過研究已經(jīng)證明草蓯蓉乙醇提取物可較好的防治四氯化碳誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化。2005年世界華人消化雜志發(fā)表樸熙緒等關(guān)于草蓯蓉乙醇提取物對二甲基亞硝胺誘導(dǎo)大鼠肝纖維化的治療作用的論文，通過采血及取肝組織檢測各項指標，結(jié)果草蓯蓉組與模型組相比肝纖維化的程度減輕

5、,而且發(fā)現(xiàn)在肝組織中α-平滑肌肌動蛋白（α- SMA）表達下降，實驗表明草蓯蓉可能通過抑制肝星狀細胞的激活和抗脂質(zhì)過氧化物作用來防治大鼠肝纖維化的發(fā)生。吳春松等通過豬血清誘導(dǎo)大鼠發(fā)生肝纖維化制造模型，實驗研究發(fā)現(xiàn)草蓯蓉可以使PCⅢ、CⅣ的作用降低，并能抑制轉(zhuǎn)化生長因子及α-平滑肌肌動蛋白的表達。并且經(jīng)過病理組織學(xué)檢查，草蓯蓉能夠明顯改善模型中大鼠的肝臟纖維化。并且具有抑制大鼠肝星狀細胞增殖和膠原合成作用。
　　目的：本實驗以大鼠肝

6、星狀細胞株（HSC-T6）作為實驗對象，研究草蓯蓉乙醇提取物對其生長抑制及誘導(dǎo)凋亡的影響。在此基礎(chǔ)上，進一步探討了凋亡調(diào)節(jié)蛋白、Akt/p70S6k信號通路對HSC增殖和凋亡的調(diào)節(jié)機制及Ⅰ膠原表達的影響。為草蓯蓉成為防治肝纖維化的有效天然藥物提供有利依據(jù)。
　　方法：本實驗選用大鼠肝星狀細胞株（HSC-T6）作為實驗對象進行體外培養(yǎng)，用MTT比色法測定不同濃度、不同時間段草蓯蓉乙醇提取物對HSC-T6的抗增殖作用；應(yīng)用倒置顯微鏡、

7、HE染色光學(xué)顯微鏡、吖啶橙/溴化乙錠雙染色熒光顯微鏡及掃描電鏡技術(shù)觀察藥物作用后的細胞形態(tài)學(xué)改變；應(yīng)用流式細胞儀（Fluorescence Activated Cell Sorter，F(xiàn)ACS）檢測細胞周期及細胞凋亡率的變化。應(yīng)用RT-PCR法檢測Ⅰ型膠原α1（I）mRNA的表達，觀察膠原合成的變化。Western Blotting法檢測凋亡調(diào)節(jié)蛋白Bcl-2、Bax、caspase-3和caspase-9；Akt/p70S6k信號通路

8、中總的Akt和p70S6k及磷酸化的Akt和p70S6k；Ⅰ型膠原蛋白，用于觀察凋亡調(diào)節(jié)蛋白和信號通路對肝星狀細胞的抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的調(diào)節(jié)機制。
　　結(jié)果：①MTT實驗表明：草蓯蓉乙醇提取物能有效抑制HSC-T6細胞增殖，并呈現(xiàn)出濃度以及時間的依賴性關(guān)系。②形態(tài)學(xué)變化：通過 HE染色、AO/EB熒光染色、TUNEL染色、以及透射和掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)草蓯蓉乙醇提取物作用于HSC-T6細胞后出現(xiàn)典型的細胞凋亡形態(tài)學(xué)變化：細胞表面的微絨

9、毛消失，體積變小，胞質(zhì)濃縮，核染色質(zhì)邊集、細胞核固縮、并出現(xiàn)核碎裂、出泡等現(xiàn)象。③流式細胞儀檢測：經(jīng)草蓯蓉乙醇提取物處理后大鼠肝星狀細胞（HSC-T6）的細胞周期被阻滯于 G0/G1期，并且與對照組相比凋亡率明顯上升，有統(tǒng)計學(xué)差異，凋亡率隨藥物濃度的升高而呈增高趨勢。④Western Blotting法測定Bax、Bcl-2、caspase-3和caspase-9表明：草蓯蓉乙醇提取物顯著上調(diào)促凋亡蛋白，Bax明顯增加，而抗凋亡蛋白 B

10、cl-2則顯著降低，且兩者都表現(xiàn)劑量依賴性，導(dǎo)致Bax/Bcl-2比值上升。草蓯蓉還明顯增加活化的caspase-3和活化的caspase-9蛋白水平。⑤Western Blotting法檢測測定Akt和p70S6表明：草蓯蓉乙醇提取物明顯能抑制磷酸化的Akt和p70S6k水平，而總的Akt和p70S6k水平無改變，表明Akt/p70S6k信號通路受到抑制。⑥Real-timePCR和Western Blotting法測定Ⅰ膠原表達顯示

11、：草蓯蓉乙醇提取物能顯著抑制Ⅰ型膠原α1（I）mRNA的表達和下調(diào)Ⅰ型膠原蛋白的表達。
　　結(jié)論：①草蓯蓉乙醇提取物在體外可明顯抑制HSC-T6的增殖。②草蓯蓉乙醇提取物在體外可誘導(dǎo)大鼠肝星狀細胞（HSC-T6）凋亡,并使細胞周期阻滯于G0/G1期。③草蓯蓉乙醇提取物顯著上調(diào)活化的caspase-3和 caspase-9；下調(diào)Bcl-2/Bax比率。④草蓯蓉乙醇提取物明顯抑制PDGF激活的Akt/p70S6k信號通路。⑤草蓯蓉乙醇