雙環(huán)醇對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞增殖與凋亡、線粒體膜電位和Casepase3的影響.pdf

1、肝纖維化(hepatic fibrosis,HF)發(fā)生的中心事件是由于肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell,HSC)激活,細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)生成過(guò)多、降解相對(duì)不足,在肝內(nèi)大量沉積。在HF恢復(fù)期,HSC凋亡明顯增多,一方面消除了ECM的來(lái)源,另一方面也解除了金屬蛋白酶組織抑制物(tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMP)對(duì)基質(zhì)金屬蛋白

2、酶(matrix metalloproteinases,MMPs)的抑制作用,從而促進(jìn)胞外基質(zhì)的降解。因此,誘導(dǎo)活化HSC凋亡可使HF發(fā)生逆轉(zhuǎn)。雙環(huán)醇是中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所研制的抗肝炎新藥,其化學(xué)名為6-甲氧羧基-15-羥甲基-2,3,2,3-雙亞甲二氧基4,4-二甲氧基聯(lián)苯。研究表明雙環(huán)醇對(duì)各種實(shí)驗(yàn)性急、慢性肝損傷均有保護(hù)作用;臨床上治療慢性乙型、丙型肝炎已取得較好的效果。有研究顯示雙環(huán)醇可以使肝纖維化大鼠的Ⅲ前膠原肽(PIIIP

3、)水平下降;同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)臨床上雙環(huán)醇對(duì)慢性乙型肝炎的肝纖維化有效。推測(cè)雙環(huán)醇可能通過(guò)增加HSCs的凋亡,從而達(dá)到治療肝纖維化的作用。
　　 目的:本實(shí)驗(yàn)通過(guò)設(shè)計(jì)不同濃度的雙環(huán)醇干預(yù)體外培養(yǎng)的肝星狀細(xì)胞,研究它對(duì)激活的肝星狀細(xì)胞增殖與凋亡的影響;對(duì)肝星狀細(xì)胞線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential,MMP)的影響;對(duì)細(xì)胞凋亡酶Caspase3活性的影響。
　　 方法:體外培養(yǎng)大鼠肝星狀

4、細(xì)胞,進(jìn)行以下分組:①對(duì)照組;②0.01mmol/l雙環(huán)醇組;③0.1mmol/l雙環(huán)醇組;④0.5mmol/l雙環(huán)醇組;⑤不含DMSO組;⑥AC-DEVD-CHO組。
　　 應(yīng)用MTT法、3H-TdR摻入法檢測(cè)雙環(huán)醇對(duì)激活肝星狀細(xì)胞增殖的影響。用Hoechst3325染色熒光顯微鏡下檢測(cè)細(xì)胞凋亡率;JC-1染色激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)HSCs線粒體膜電位,流式細(xì)胞儀檢測(cè)HSCs線粒體膜電位;應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)Caspase3的酶活性。

5、
　　 結(jié)果:①不同濃度的雙環(huán)醇對(duì)HSCs增殖的影響:MTT法檢測(cè)顯示,對(duì)照組與不含DMSO組A490值無(wú)差別,說(shuō)明0.02％DMSO對(duì)HSCs增殖沒(méi)有影響(P＞0.05);對(duì)照組的A490值總體均數(shù)與不同濃度的雙環(huán)醇組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),0.1mM及0.5mM雙環(huán)醇組最低,說(shuō)明雙環(huán)醇對(duì)活化的肝星狀細(xì)胞增殖有抑制作用,抑制作用與藥物濃度有關(guān),濃度越高,雙環(huán)醇的抑制作用最強(qiáng)。3H-TdR摻入法檢測(cè)同樣顯示,0.1m

6、M及0.5mM雙環(huán)醇組低于對(duì)照組,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),進(jìn)一步說(shuō)明雙環(huán)醇對(duì)活化肝星狀細(xì)胞增殖有抑制作用,藥物濃度越高作用越強(qiáng),0.5mM組抑制增殖作用最強(qiáng)。②0.5mM雙環(huán)醇干預(yù)HSCs不同時(shí)間對(duì)增殖的影響:MTT法檢測(cè)顯示,各組間抑制率總體均數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),抑制率與干預(yù)時(shí)間有相關(guān)性,12h后開始抑制HSCs增殖,24h及36h到高峰,48h后抑制率有所下降。③不同濃度的雙環(huán)醇對(duì)HSCs的細(xì)胞凋亡的影響:

7、Hoechest3325染色熒光顯微鏡下檢測(cè)顯示,雙環(huán)醇干預(yù)HSCs后,細(xì)胞核濃縮、出現(xiàn)凋亡小體;干預(yù)細(xì)胞24h后,對(duì)照組、DMSO組及0.01mM組組間的細(xì)胞凋亡率無(wú)差別(P＞0.05),0.5mM組凋亡率最高,與對(duì)照組、0.1mM組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),說(shuō)明雙環(huán)醇的濃度對(duì)活化的肝星狀細(xì)胞凋亡率有影響,濃度越高則凋亡率越高;0.5mmol/l的雙環(huán)醇促進(jìn)活化的肝星狀細(xì)胞凋亡作用最強(qiáng)。④0.5mM雙環(huán)醇干預(yù)HSCs不同時(shí)間

8、對(duì)凋亡率的影響:雙環(huán)醇干預(yù)HSCs8h的凋亡率與干預(yù)前凋亡率無(wú)差別(P＞0.05),作用細(xì)胞24h和作用32h后細(xì)胞凋亡達(dá)到最高值,凋亡率總體差異有意義(P＜0.05),說(shuō)明凋亡率與雙環(huán)醇作用時(shí)間相關(guān),時(shí)間長(zhǎng),凋亡率高,24h-32h達(dá)到最高。⑤0.5mM雙環(huán)醇對(duì)HSCs線粒體膜電位的影響:JC-1試劑盒激光共聚焦掃描顯微鏡法檢測(cè)線粒體膜電位,8h組、16h組與陽(yáng)性對(duì)照組的膜電位無(wú)差別(P＞0.05),均低于陰性對(duì)照組,線粒體膜電位差異

9、有意義(P＜0.05),24小時(shí)后線粒體膜電位較16h有所回升(P＜0.05),說(shuō)明雙環(huán)醇可降低活化的肝星狀細(xì)胞的線粒體膜電位,且與雙環(huán)醇作用時(shí)間有相關(guān)性,在8h、16h作用最強(qiáng)。JC-1試劑盒流式細(xì)胞儀法檢測(cè)線粒體膜電位,0.5mM雙環(huán)醇組與對(duì)照組在8h、16h的線粒體膜電位均低于對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),說(shuō)明雙環(huán)醇可降低肝星狀細(xì)胞線粒體膜電位;雙環(huán)醇干預(yù)8h至16h線粒體膜電位較前下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.0

10、5),說(shuō)明雙環(huán)醇降低活化的肝星狀細(xì)胞的線粒體膜電位與時(shí)間相關(guān),8h-16h線粒體膜電位最低。⑥Caspase3活性檢測(cè)顯示:0.5mmol/l的雙環(huán)醇、0.1mmol/l的雙環(huán)醇作用活化的肝星狀細(xì)胞24h后,較對(duì)照組Casepase3的活性(1.170±0.123)增高到(2.327±0.179)及(21.643±0.055),Caspase3活性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),說(shuō)明雙環(huán)醇對(duì)Casepase3活性有影響,與藥物濃度有關(guān)

11、,0.5mM組的Caspase3的活性最高,0.5mM的雙環(huán)醇可明顯增高Caspase3的活性,而Ac-EDVE-CHO可抑制雙環(huán)醇增高Caspase3的活性的作用。
　　 結(jié)論:①體外細(xì)胞培養(yǎng)研究表明,雙環(huán)醇可抑制活化的HSCs的增殖,最有效濃度為0.5mmol/l,在24h-36h對(duì)活化的HSCs增殖抑制作用最強(qiáng)。②雙環(huán)醇可促進(jìn)活化的HSCs凋亡,濃度為0.5mmol/l作用最強(qiáng),促凋亡作用隨時(shí)間延長(zhǎng)而加強(qiáng),在24h-32h