頭部淺低溫對全腦缺血再灌注損傷大鼠海馬細胞線粒體膜電位及細胞凋亡的影響.pdf

1、目的:阻斷大鼠雙側椎動脈和雙側頸總動脈造成全腦缺血，開放血管后造成再灌注損傷，經(jīng)鼻咽腔實施冷鹽水灌注來降低大腦深部溫度，實現(xiàn)頭部的淺低溫，通過檢測缺血再灌損傷后大鼠海馬細胞線粒體膜電位的變化，以及觀察海馬CA1區(qū)Bcl-2，Bax蛋白，細胞色素C(Cytochrome C，CytC)蛋白和Pro-Caspase-3蛋白的表達，來探究線粒體膜電位變化與細胞凋亡的關系，以及頭部淺低溫減少缺血再灌注損傷的理論基礎。
　　方法:
　

2、　1實驗動物分組
　　36只清結級成年Wistart大鼠，均為雄性，體重250～280g。隨機分成3組，每組12只，標記為假手術組即S組，缺血再灌注組即I/R組，頭部淺低溫缺血再灌注組即HI/R組。
　　2實驗模型的建立以及頭部淺低溫的實施
　　基于大鼠全腦四血管供血的解剖學基礎[1，3]，永久性閉塞雙側椎動脈后，夾閉雙側頸總動脈造成全腦缺血，開放動脈夾復灌制造缺血再灌注損傷模型，經(jīng)鼻咽降溫實現(xiàn)頭部淺低溫。大鼠禁食大于

3、8小時，記錄體重，腹腔注射水合氯醛麻醉，待其對針尖刺激無反應后俯臥固定，在顱骨下觸及第一頸椎，沿中線切開分離組織直至脊椎骨，暴露椎旁兩側翼小孔，用電燒尖燒閉雙側椎動脈，檢驗無出血后逐層縫合。觀察24h再次麻醉大鼠，仰臥固定，插入氣管導管，持續(xù)吸入七氟醚，經(jīng)鼠頸分離雙側粗大頸總動脈，準備動脈夾。S組大鼠僅分離出雙側翼小孔和頸總動脈，不予其它處理。I/R組，HI/R組均燒灼翼小孔閉塞椎動脈，夾閉雙側頸總動脈15min，開放灌注24小時。其中

4、HI/R組在氣管插管后于鼻腔置入管路，灌注4℃晶體液降低腦溫，待海馬區(qū)溫度達33℃時進行雙側頸總動脈夾閉，開放動脈復灌1小時后停止降溫，自然復溫。
　　3實驗樣本提取及檢測方法
　　3.1 JC-1熒光法顯微鏡下觀察大鼠海馬細胞線粒體膜電位變化
　　每組取大鼠4只，腹腔注射10％水合氯醛麻醉后迅速斷頭，取出大腦放于冰盤上分離海馬組織，標本參照線粒體提取試劑盒使用方法提取線粒體，操作過程于低溫環(huán)境下進行，標本用于線粒體膜

5、電位的觀察。
　　3.2 Western Blot法測定Caspase-3酶原
　　每組取再灌注24小時大鼠4只，10％水合氯醛進行麻醉，于鼠頸根部斷頭，低溫下分取鼠腦海馬組織，置于冷凍管密封，在液氮罐中快速超低溫冰凍標本，再轉移到-80℃冰箱長時間保存。標本用Western Blot方法測定Caspase-3酶原表達。
　　3.3免疫組化法觀察海馬CA1區(qū)CytC蛋白，Bcl-2及Bax蛋白表達
　　每組取大鼠

6、4只麻醉，剪開胸廓于心尖處插入細針，以0.9％氯化鈉灌注清洗血管，再以4％多聚甲醛溶液灌流固定，待大鼠全身僵直后即刻斷頭取腦分離海馬組織，標本放入4％多聚甲醛溶液中繼續(xù)固定，4℃保存，用免疫組化法觀察Cyt C蛋白，Bcl-2蛋白及Bax蛋白。
　　結果:
　　1大鼠海馬CA1區(qū)Caspase-3酶原表達
　　相比于S組，I/R組Caspase-3酶原蛋白量減少，HI/R組Caspase-3酶原蛋白量減少，差異顯著，有

7、統(tǒng)計學意義(P＜0.05);相比于I/R組，HI/R組Caspase-3酶原蛋白量增加，差異顯著，有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　2大鼠海馬CA1區(qū)Cyt C蛋白表達
　　相比于S組，I/R組，HI/R組Cyt C蛋白表達均明顯增加，有統(tǒng)計學差異(P＜0.05);相比于I/R組，HI/R組Cyt C蛋白表達明顯減少，有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。
　　3大鼠海馬CA1區(qū)Bcl-2、Bax蛋白表達
　　相比于S

8、組，I/R組，HI/R組Bcl-2蛋白，Bax蛋白表達均明顯增加，有統(tǒng)計學差異(P＜0.05);相比于I/R組，HI/R組Bcl-2蛋白表達明顯增加，Bax蛋白表達明顯減少，兩者均有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。
　　4大鼠海馬CA1區(qū)細胞線粒體膜電位的觀察
　　S組在JC-1熒光濾片上觀察為高紅高綠（綠++紅++），染料聚集明顯，是膜電位正常時的熒光圖像;與S組比較，I/R組明顯表現(xiàn)為低紅高綠（綠++紅），紅色熒光下僅有極少