頭部淺低溫對(duì)全腦缺血再灌注損傷大鼠線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔及細(xì)胞調(diào)亡的影響.pdf

1、目的:本實(shí)驗(yàn)通過四血管阻斷法制備大鼠全腦缺血再灌注模型，在此基礎(chǔ)上運(yùn)用鼻咽腔降溫法對(duì)大鼠進(jìn)行頭部淺低溫，并應(yīng)用線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)的開放劑蒼術(shù)苷在大鼠全腦缺血前進(jìn)行側(cè)腦室注射，來觀察再灌注期間大鼠海馬MPTP的開放情況，海馬CA1區(qū)細(xì)胞色素C(Cytochrome C，Cyt C)蛋白、 Bcl-2蛋白及Bax蛋白的表達(dá)。研究頭部淺低溫對(duì)全腦

2、缺血再灌注損傷大鼠MPTP及細(xì)胞凋亡的影響，進(jìn)一步探討淺低溫腦保護(hù)的作用機(jī)制，為以后臨床治療腦缺血再灌注損傷疾病提供新的理論依據(jù)。
　　方法:
　　1、實(shí)驗(yàn)分組
　　體重250～300g的健康雄性清結(jié)級(jí)SD大鼠72只（由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心供應(yīng)）。將大鼠隨機(jī)分成6組(n=12):假手術(shù)組（S組）、全腦缺血/再灌注組(IR組)、低溫組（H組）、蒼術(shù)苷組（A組）、低溫+蒼術(shù)苷組(HA組)、低溫+生理鹽水組（HN組）。<

3、br>　　2、全腦缺血再灌注模型制備
　　制備大鼠全腦缺血再灌注模型應(yīng)用的是改良的Pulsinelli四血管阻斷法。大鼠常規(guī)禁食8小時(shí)，無需禁水，稱重后10％水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉。麻醉成功后俯臥固定于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)臺(tái)，于頸后正中第一、二頸椎處剪毛消毒后切開皮膚，逐層分離，暴露雙側(cè)翼小孔。用自制電烙鐵燒灼兩側(cè)翼小孔內(nèi)椎動(dòng)脈使其永久閉塞，縫合皮膚。24 h后相同方法麻醉大鼠，仰臥固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，氣管插管保留自主呼吸吸氧

4、，頸前正中剪毛消毒切開皮膚，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，穿線備用。此過程中，大鼠間斷吸入七氟醚維持麻醉，尾靜脈穿刺置管持續(xù)泵入乳酸鈉林格氏液維持循環(huán)。
　　3、實(shí)驗(yàn)處理及監(jiān)測(cè)
　　大鼠全腦缺血時(shí)間為15min，再灌注24 h。不同組給予不同處理:
　　S組作為假手術(shù)組只暴露雙側(cè)翼小孔，不燒灼椎動(dòng)脈;只分離頸總動(dòng)脈，不對(duì)其夾閉。其它五組都燒灼椎動(dòng)脈夾閉頸總動(dòng)脈，制成全腦缺血再灌注模型。其中，H組、HA組和HN組進(jìn)行低溫處理:在大鼠

5、氣管插管后，咽喉部氣管插管旁置入棉球和吸痰管（低溫過程中持續(xù)吸引）以防止誤吸，雙側(cè)鼻腔置入20G硅膠管，深度約為20 mm，持續(xù)泵入4-5℃的冷鹽水，速度為100 ml·min-1·kg-1，實(shí)施頭部淺低溫，等到海馬溫度降至（33.0±0.5）℃后，雙側(cè)頸總動(dòng)脈閉塞15 min，低溫維持1h后保持自然復(fù)溫。HA組和A組于再灌注前10 min蒼術(shù)苷15 ul左側(cè)腦室緩慢注射。HN組左側(cè)腦室注射等量生理鹽水。術(shù)中監(jiān)測(cè)腦電圖（頭皮刺入電極）、

6、心電圖（四肢皮下刺入電極）、海馬溫度（溫度探頭置入右側(cè)海馬CA1區(qū)即前囟后3.6 mm、中線右旁開3 mm和皮層下2 mm）以及直腸溫度（維持在37.0±0.5℃）。
　　4、標(biāo)本制備及檢測(cè)
　　4.1紫分光光度儀檢測(cè)海馬MPTP開放情況
　　再灌注24 h后，每組取6只大鼠進(jìn)行麻醉（10％水合氯醛腹腔注射），然后迅速斷頭分離出海馬組織，根據(jù)線粒體提取試劑盒說明提取海馬線粒體，整個(gè)過程均在0～4℃下完成。提出的線粒體用

7、于MPTP開放情況的檢測(cè)。
　　4.2免疫組織化學(xué)法測(cè)定海馬CA1區(qū)Cyt C蛋白、Bcl-2蛋白及Bax蛋白的表達(dá)
　　每組取另外6只大鼠麻醉成功后，用4％多聚甲醛迅速經(jīng)心灌流固定，固定后快速斷頭取出腦組織并繼續(xù)固定于4％多聚甲醛中，然后放入4℃冰箱中保存，用于免疫組織化學(xué)檢測(cè)。
　　結(jié)果:
　　1、六組大鼠體重比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　2、大鼠海馬神經(jīng)元MPTP開放程度的比較
　

8、　與S組相比，其余各組MPTP吸光值減少程度均增大，MPTP開放程度增加(P＜0.05);與IR組比，H組、HA組和HN組MPTP吸光值減少程度降低，MPTP開放程度減小(P＜0.05);與H組比較，HA組MPTP吸光值減少程度增加，MPTP開放程度增加(P＜0.05)。
　　3、大鼠海馬CA1區(qū)Cyt C蛋白的比較
　　與S組相比，其余五組Cyt C蛋白表達(dá)均增多(P＜0.05);與IR組相比，H組、HN組和HA組Cyt

9、C蛋白表達(dá)均減少(P＜0.05);與H組相比，HA組Cyt C蛋白表達(dá)增多(P＜0.05)。H組和HN組、IR組和A組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　4、大鼠海馬CA1區(qū)Bax、 Bcl-2蛋白表達(dá)及Bcl-2/Bax的比較
　　與S組比較，其它五組Bax蛋白、Bcl-2蛋白表達(dá)均增加，H組和HN組Bcl-2/Bax比值升高，IR組和A組Bcl-2/Bax比值降低(P＜0.05);與IR組比較，H組和HN組Bc

10、l-2蛋白表達(dá)增加、Bax蛋白表達(dá)減少、Bcl-2/Bax比值升高(P＜0.05);與H組和HN組比較，HA組Bcl-2蛋白表達(dá)減少、Bax蛋白表達(dá)增多、Bcl-2/Bax比值降低(P＜0.05)。H組和HN組比較、IR組和A組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　結(jié)論:
　　1、頭部淺低溫可有效減輕大鼠全腦缺血再灌注損傷，抑制細(xì)胞凋亡，有神經(jīng)保護(hù)作用。
　　2、頭部淺低溫的腦保護(hù)作用機(jī)制與抑制海馬細(xì)胞MPT