七氟烷對大鼠肺缺血再灌注后組織通透性的影響.pdf

1、肺缺血再灌注損傷臨床上常見于肺移植術、體外循環(huán)手術、肺栓塞溶栓治療和休克等，缺血再灌注損傷導致的肺功能不全是肺移植術后死亡的主要原因，也是影響體外循環(huán)病人預后、住院時間的重要因素。休克、心肺復蘇及肺外組織器官缺血時肺再灌注損傷是病程早期出現(xiàn)呼吸功能不全的主要原因。肺缺血再灌注損傷在臨床多見，探尋其發(fā)生機制和有效可行的防治方法是近年來人們研究的熱點方向。 大量的研究認為氟烷、安氟醚、異氟醚、七氟烷等對心肌、腦、肝、腎臟再灌注損傷具

2、有保護作用。關于吸入麻醉藥對再灌注后肺組織影響的研究較少，且研究結果也不一致。Nielsen等發(fā)現(xiàn)地氟醚增加主動脈鉗夾再灌注后肺泡毛細血管膜的通透性。陳艷平等研究表明異氟醚減輕離體兔肺模型缺血再灌注后肺水腫a七氟烷具有麻醉誘導、蘇醒迅速，血流動力學穩(wěn)定的特點，在臨床上得到廣泛應用。七氟烷對正常狀態(tài)下肺組織形態(tài)并無影響，對缺血再灌注后肺組織的作用還有待于進一步研究。 缺血再灌注后肺損傷主要表現(xiàn)為肺血管通透性增強，肺水含量增多。近年

3、來隨著分子生物學的進展，對血管通透性的形成機制有了更深入的認識。內皮和上皮細胞之間的裂隙是液體、大分子物質透出的主要途徑。細胞連接，尤其是緊密連接(TJ,tightjunction)，結構和功能的完整性對維持肺組織通透性具有重要意義。本研究擬通過建立在體大鼠肺缺血再灌注損傷模型，觀察缺血和再灌注不同時點肺血管通透性和病理形態(tài)學變化，并從生化、分子生物學水平探討缺血再灌注后肺損傷和七氟烷肺保護的可能機制，為臨床預防和治療肺缺血再灌注損傷合

4、理選擇用藥提供理論依據(jù)。 本研究分為三部分： 1、七氟烷對缺血再灌注后大鼠肺組織通透性的影響； 2、七氟烷對缺血再灌注后大鼠肺組織TNF-α和PKC-α表達的影響； 3、七氟烷對缺血再灌注后大鼠肺組織緊密連接蛋白occludin和ZO-1的影響。實驗材料一、實驗動物健康雄性wistar大鼠96只，體重250g～350g。 一、實驗主要試劑及藥品： 七氟烷(Baxter公司，美國)抗PKC-

5、α一抗(Sigma公司，美國)抗occludin一抗(Santa-Cruz公司，美國)抗ZO-1一抗(Santa-Cruz公司，美國)蛋白提取試劑盒(南京凱基生物公司)RT-PCR試劑盒和DNA聚合酶(TaKaRa公司，日本)引物(TaKaRa公司，日本)RNA提取試劑盒、RNA裂解液(上海生工公司)三、實驗主要儀器西門子監(jiān)護儀(Sirecust730，德國)微量輸液泵(Braun公司，德國)Detax氣體監(jiān)護儀(芬蘭)Drager麻醉

6、機(美國)動物呼吸機(浙江)飛力普透射電鏡(CM-10型，德國)超薄切片機(8800型，瑞典)紫外分光光度計(島滓UV-260型，日本)電泳儀(BIO-RAD-PAC300型，美國)電泳槽(BIO-RAD mini，美國)轉印槽(Tanon，天津)組織超聲勻漿器(UP200H，美國)高速臺式冷凍離心機(Heraeus-Biofuge-PrimoR，德國)PCR擴增儀(TaKaRa TP-600，日本)凝膠成像分析系統(tǒng)(Tanon GIS

7、-2020，天津)實驗方法一、動物模型參照改良的Eppinger方法建立在體大鼠肺缺血再灌注損傷模型。雄性wistar大鼠，20％烏拉坦3.3ml.kg-1腹腔注射麻醉，左開胸后阻斷肺門45min，開放血流再灌注。 二、實驗分組： 對照組(C)：開胸游離左肺門，未行肺門阻斷； 缺血再灌注組(IR)：阻斷左肺門45min后開放血流再灌注； 七氟烷組(Sev-C)：吸入七氟烷30min后游離左肺門，未行肺門阻

8、斷： 七氟烷缺血再灌注組(Sev-IR)：吸入七氟烷30min，左肺門阻斷45min后開放血流再灌注。 每組包括3個時點：缺血阻斷45min、再灌注60min、再灌注120min，其中再灌注120min時另外有6只大鼠行支氣管灌洗，收集支氣管灌洗液。 三、觀察指標和方法： 1)血流動力學變化； 2)肺組織病理檢查(光鏡)； 3)肺泡和毛細血管超微結構的檢查(電鏡)； 4)肺水含量(

9、W/D)4)肺組織和支氣管灌洗液蛋白含量(化學法)。 5)肺組織TNF-α含量(ELISA法)6)PKC-α在細胞膜和胞漿的表達；occludin和ZO-1在肺組織的表達(western-blot法)7)occludin和ZO-lmRNA表達的變化(RT-PCR法)8)occludin和ZO-1在細胞內的定位(免疫組化法)四、統(tǒng)計學處理所有數(shù)據(jù)采用SPSS11.5統(tǒng)計學分析軟件進行處理，測定結果用均數(shù)士標準差(X±S)表示，組間

10、比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Student-Newman-Keuls方法檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。 實驗結果： 1、七氟烷對缺血再灌注后大鼠肺組織通透性的影響1、血流動力學變化各組在缺血和再灌注期間MAP平穩(wěn)。IR和Sev-IR組再灌注后SpO2逐漸下降(P<0.05)，兩組間無明顯差異(P>0.05)，再灌注60min和120min比較SpO2差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。 2、肺組織通

11、透性的改變IR組和Sev-IR 組再灌注后W/D、肺通透指數(shù)明顯升高(P<0.05)，再灌注120min達到峰值。Sev-IR組的變化低于瓜組(P<0.05)。 3、光鏡檢查： IR組肺毛細血管擴張充血，肺泡間隔水腫增寬，間質炎性細胞浸潤，肺泡腔內紅細胞、炎性細胞滲出。隨著再灌注時間的延長，損傷改變逐漸加重。Sev-IR組病理改變和IR組比較明顯減輕，間質和肺泡腔內滲出減少。 4、電鏡檢查： IR組再灌注

12、120min時內皮細胞間緊密連接帶斷開、結構松散。Sev-IR組再灌注120min相鄰的內皮細胞間質膜緊靠，未見縫隙，無緊密連接斷裂。各組肺泡上皮細胞問的緊密連接均保持完整。 二、七氟烷對缺血再灌注后大鼠肺組織TNF-α和PKC-α表達的影響： 1、IR組再灌注后肺組織TNF-α含量明顯增加(P<0.05)，再灌注120min達峰值。Sev-IR組TNE-α上升的程度明顯低于IR組(P<0.05)。 2、IR組再

13、灌注后肺組織PKC-α在細胞膜表達增加(P<0.05)，細胞漿的表達減少(P<0.05)，再灌注120min變化最顯著。Sev-IR組PKC-α在細胞膜表達增加、胞漿減少的程度都低于IR組(P<0.05)。 三、七氟烷對缺血再灌注后大鼠肺組織occludin和ZO-1表達的影響： 1、TJ蛋白表達的差異IR組再灌注后occludin光密度值明顯降低，再灌注120min達最低值(P<0.05)。ZO-1光密度值也同步下降(

14、P<0.05)。Sev-IR組octludin和ZO-1光密度值下降的程度明顯低于IR組(P<0.05)。 2、TJ蛋白mRNA水平的差異IR組occludin/β-actin光密度比值再灌注后明顯降低，再灌注120min時比值最低(P<0.05)。ZO-1/β-actin光密度比值再灌注后也同步下降，120min達最低值(P<0.05)。Sev-IR 組occludin/β-actin和ZO-1/β-actin下降程度明顯低于

15、IR組(P<0.05)。 3、TJ蛋白在細胞內的定位IR組occludin和ZO-1染色明顯變淺，再灌注120min最顯著(P<0.05)。Sev-IR組TJ蛋白染色變淺程度減輕(P<0.05)。Occludin和ZO-1定位于細胞膜和靠近胞膜的胞漿，在血管內皮細胞和肺泡上皮細胞都可見染色，在相鄰細胞間著色更深。 結論： 1、缺血再灌注后大鼠肺組織通透性增加，七氟烷預處理使組織通透性下降，對再灌注后肺組織有保護作