七氟烷對(duì)大鼠肺缺血再灌注后組織通透性的影響.pdf

1、肺缺血再灌注損傷臨床上常見(jiàn)于肺移植術(shù)、體外循環(huán)手術(shù)、肺栓塞溶栓治療和休克等，缺血再灌注損傷導(dǎo)致的肺功能不全是肺移植術(shù)后死亡的主要原因，也是影響體外循環(huán)病人預(yù)后、住院時(shí)間的重要因素。休克、心肺復(fù)蘇及肺外組織器官缺血時(shí)肺再灌注損傷是病程早期出現(xiàn)呼吸功能不全的主要原因。肺缺血再灌注損傷在臨床多見(jiàn)，探尋其發(fā)生機(jī)制和有效可行的防治方法是近年來(lái)人們研究的熱點(diǎn)方向。 大量的研究認(rèn)為氟烷、安氟醚、異氟醚、七氟烷等對(duì)心肌、腦、肝、腎臟再灌注損傷具

2、有保護(hù)作用。關(guān)于吸入麻醉藥對(duì)再灌注后肺組織影響的研究較少，且研究結(jié)果也不一致。Nielsen等發(fā)現(xiàn)地氟醚增加主動(dòng)脈鉗夾再灌注后肺泡毛細(xì)血管膜的通透性。陳艷平等研究表明異氟醚減輕離體兔肺模型缺血再灌注后肺水腫a七氟烷具有麻醉誘導(dǎo)、蘇醒迅速，血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定的特點(diǎn)，在臨床上得到廣泛應(yīng)用。七氟烷對(duì)正常狀態(tài)下肺組織形態(tài)并無(wú)影響，對(duì)缺血再灌注后肺組織的作用還有待于進(jìn)一步研究。 缺血再灌注后肺損傷主要表現(xiàn)為肺血管通透性增強(qiáng)，肺水含量增多。近年

3、來(lái)隨著分子生物學(xué)的進(jìn)展，對(duì)血管通透性的形成機(jī)制有了更深入的認(rèn)識(shí)。內(nèi)皮和上皮細(xì)胞之間的裂隙是液體、大分子物質(zhì)透出的主要途徑。細(xì)胞連接，尤其是緊密連接(TJ,tightjunction)，結(jié)構(gòu)和功能的完整性對(duì)維持肺組織通透性具有重要意義。本研究擬通過(guò)建立在體大鼠肺缺血再灌注損傷模型，觀察缺血和再灌注不同時(shí)點(diǎn)肺血管通透性和病理形態(tài)學(xué)變化，并從生化、分子生物學(xué)水平探討缺血再灌注后肺損傷和七氟烷肺保護(hù)的可能機(jī)制，為臨床預(yù)防和治療肺缺血再灌注損傷合

4、理選擇用藥提供理論依據(jù)。 本研究分為三部分： 1、七氟烷對(duì)缺血再灌注后大鼠肺組織通透性的影響； 2、七氟烷對(duì)缺血再灌注后大鼠肺組織TNF-α和PKC-α表達(dá)的影響； 3、七氟烷對(duì)缺血再灌注后大鼠肺組織緊密連接蛋白o(hù)ccludin和ZO-1的影響。實(shí)驗(yàn)材料一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康雄性wistar大鼠96只，體重250g～350g。 一、實(shí)驗(yàn)主要試劑及藥品： 七氟烷(Baxter公司，美國(guó))抗PKC-

5、α一抗(Sigma公司，美國(guó))抗occludin一抗(Santa-Cruz公司，美國(guó))抗ZO-1一抗(Santa-Cruz公司，美國(guó))蛋白提取試劑盒(南京凱基生物公司)RT-PCR試劑盒和DNA聚合酶(TaKaRa公司，日本)引物(TaKaRa公司，日本)RNA提取試劑盒、RNA裂解液(上海生工公司)三、實(shí)驗(yàn)主要儀器西門(mén)子監(jiān)護(hù)儀(Sirecust730，德國(guó))微量輸液泵(Braun公司，德國(guó))Detax氣體監(jiān)護(hù)儀(芬蘭)Drager麻醉

6、機(jī)(美國(guó))動(dòng)物呼吸機(jī)(浙江)飛力普透射電鏡(CM-10型，德國(guó))超薄切片機(jī)(8800型，瑞典)紫外分光光度計(jì)(島滓UV-260型，日本)電泳儀(BIO-RAD-PAC300型，美國(guó))電泳槽(BIO-RAD mini，美國(guó))轉(zhuǎn)印槽(Tanon，天津)組織超聲勻漿器(UP200H，美國(guó))高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(Heraeus-Biofuge-PrimoR，德國(guó))PCR擴(kuò)增儀(TaKaRa TP-600，日本)凝膠成像分析系統(tǒng)(Tanon GIS

7、-2020，天津)實(shí)驗(yàn)方法一、動(dòng)物模型參照改良的Eppinger方法建立在體大鼠肺缺血再灌注損傷模型。雄性wistar大鼠，20％烏拉坦3.3ml.kg-1腹腔注射麻醉，左開(kāi)胸后阻斷肺門(mén)45min，開(kāi)放血流再灌注。 二、實(shí)驗(yàn)分組： 對(duì)照組(C)：開(kāi)胸游離左肺門(mén)，未行肺門(mén)阻斷； 缺血再灌注組(IR)：阻斷左肺門(mén)45min后開(kāi)放血流再灌注； 七氟烷組(Sev-C)：吸入七氟烷30min后游離左肺門(mén)，未行肺門(mén)阻

8、斷： 七氟烷缺血再灌注組(Sev-IR)：吸入七氟烷30min，左肺門(mén)阻斷45min后開(kāi)放血流再灌注。 每組包括3個(gè)時(shí)點(diǎn)：缺血阻斷45min、再灌注60min、再灌注120min，其中再灌注120min時(shí)另外有6只大鼠行支氣管灌洗，收集支氣管灌洗液。 三、觀察指標(biāo)和方法： 1)血流動(dòng)力學(xué)變化； 2)肺組織病理檢查(光鏡)； 3)肺泡和毛細(xì)血管超微結(jié)構(gòu)的檢查(電鏡)； 4)肺水含量(

9、W/D)4)肺組織和支氣管灌洗液蛋白含量(化學(xué)法)。 5)肺組織TNF-α含量(ELISA法)6)PKC-α在細(xì)胞膜和胞漿的表達(dá)；occludin和ZO-1在肺組織的表達(dá)(western-blot法)7)occludin和ZO-lmRNA表達(dá)的變化(RT-PCR法)8)occludin和ZO-1在細(xì)胞內(nèi)的定位(免疫組化法)四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件進(jìn)行處理，測(cè)定結(jié)果用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示，組間

10、比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Student-Newman-Keuls方法檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1、七氟烷對(duì)缺血再灌注后大鼠肺組織通透性的影響1、血流動(dòng)力學(xué)變化各組在缺血和再灌注期間MAP平穩(wěn)。IR和Sev-IR組再灌注后SpO2逐漸下降(P<0.05)，兩組間無(wú)明顯差異(P>0.05)，再灌注60min和120min比較SpO2差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 2、肺組織通

11、透性的改變IR組和Sev-IR 組再灌注后W/D、肺通透指數(shù)明顯升高(P<0.05)，再灌注120min達(dá)到峰值。Sev-IR組的變化低于瓜組(P<0.05)。 3、光鏡檢查： IR組肺毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，肺泡間隔水腫增寬，間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡腔內(nèi)紅細(xì)胞、炎性細(xì)胞滲出。隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，損傷改變逐漸加重。Sev-IR組病理改變和IR組比較明顯減輕，間質(zhì)和肺泡腔內(nèi)滲出減少。 4、電鏡檢查： IR組再灌注

12、120min時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接帶斷開(kāi)、結(jié)構(gòu)松散。Sev-IR組再灌注120min相鄰的內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)膜緊靠，未見(jiàn)縫隙，無(wú)緊密連接斷裂。各組肺泡上皮細(xì)胞問(wèn)的緊密連接均保持完整。 二、七氟烷對(duì)缺血再灌注后大鼠肺組織TNF-α和PKC-α表達(dá)的影響： 1、IR組再灌注后肺組織TNF-α含量明顯增加(P<0.05)，再灌注120min達(dá)峰值。Sev-IR組TNE-α上升的程度明顯低于IR組(P<0.05)。 2、IR組再

13、灌注后肺組織PKC-α在細(xì)胞膜表達(dá)增加(P<0.05)，細(xì)胞漿的表達(dá)減少(P<0.05)，再灌注120min變化最顯著。Sev-IR組PKC-α在細(xì)胞膜表達(dá)增加、胞漿減少的程度都低于IR組(P<0.05)。 三、七氟烷對(duì)缺血再灌注后大鼠肺組織occludin和ZO-1表達(dá)的影響： 1、TJ蛋白表達(dá)的差異IR組再灌注后occludin光密度值明顯降低，再灌注120min達(dá)最低值(P<0.05)。ZO-1光密度值也同步下降(

14、P<0.05)。Sev-IR組octludin和ZO-1光密度值下降的程度明顯低于IR組(P<0.05)。 2、TJ蛋白mRNA水平的差異IR組occludin/β-actin光密度比值再灌注后明顯降低，再灌注120min時(shí)比值最低(P<0.05)。ZO-1/β-actin光密度比值再灌注后也同步下降，120min達(dá)最低值(P<0.05)。Sev-IR 組occludin/β-actin和ZO-1/β-actin下降程度明顯低于

15、IR組(P<0.05)。 3、TJ蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位IR組occludin和ZO-1染色明顯變淺，再灌注120min最顯著(P<0.05)。Sev-IR組TJ蛋白染色變淺程度減輕(P<0.05)。Occludin和ZO-1定位于細(xì)胞膜和靠近胞膜的胞漿，在血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞都可見(jiàn)染色，在相鄰細(xì)胞間著色更深。 結(jié)論： 1、缺血再灌注后大鼠肺組織通透性增加，七氟烷預(yù)處理使組織通透性下降，對(duì)再灌注后肺組織有保護(hù)作