頭部淺低溫對(duì)大鼠全腦缺血再灌注損傷及mTOR通路的影響.pdf

1、目的:實(shí)驗(yàn)運(yùn)用改良的四血管阻斷法制備全腦缺血再灌注的Wistar大鼠模型，全腦缺血前經(jīng)由側(cè)腦室注射mTOR(mammalian target of rapamycin)抑制劑雷帕霉素(Rapamycin，RPM)抑制其活性，并聯(lián)合使用鼻咽腔降溫法對(duì)頭部進(jìn)行淺低溫處理，處理完成后觀察再灌注時(shí)期大鼠腦內(nèi)P70s6K、p-P70S6K（磷酸化的P70s6K）的表達(dá)以及海馬CA1區(qū)mTOR、p-mTOR(磷酸化的mTOR)的表達(dá)。研究淺低溫在頭

2、部的實(shí)施以及抑制mTOR通路的活性聯(lián)合淺低溫在頭部的實(shí)施對(duì)大鼠大腦缺血后再灌注損傷的影響，由此進(jìn)一步探討在頭部實(shí)施淺低溫對(duì)該損傷可能產(chǎn)生影響的機(jī)制，為臨床上預(yù)防或治療腦部缺血后再灌注損傷性疾病提供新的理論依據(jù)。
　　方法:
　　1.實(shí)驗(yàn)分組
　　體重250～300g的健康雄性清結(jié)級(jí)Wistar大鼠60只（由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心供應(yīng)）。將大鼠根據(jù)實(shí)驗(yàn)研究需要隨機(jī)分為5組(n=12):假手術(shù)組（S組）、全腦缺血/再灌注

3、組（I組）、低溫組（T組）、低溫+Rapamycin組（R組）、低溫+DMSO組（D組）。
　　2.全腦缺血再灌注模型制備
　　本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用改良的Pulsinelli四血管阻斷法制備大鼠全腦缺血再灌注模型。大鼠常規(guī)禁食8小時(shí)，無(wú)需禁水，稱重后進(jìn)行麻醉，以10％水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射。麻醉完成后將動(dòng)物固定在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，俯臥位進(jìn)行剪毛、消毒，在頸后正中第一、二頸椎處切開皮膚并進(jìn)行組織分離，使雙側(cè)翼小孔暴露。使用自

4、制實(shí)驗(yàn)器材的尖端深入雙側(cè)小孔中燒灼其下走行的兩側(cè)椎動(dòng)脈造成閉塞，縫合皮膚并消毒。24 h后以同樣方法再次麻醉大鼠，麻醉成功后仰臥固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，氣管插管維持自主呼吸，吸入氧氣以及間斷給予七氟醚維持麻醉。開放尾靜脈通路以1ml/h速度持續(xù)泵入乳酸鈉林格氏液以保證大鼠機(jī)體循環(huán)需要。頸前正中剪毛消毒切開皮膚，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，用4-0絲線分別穿過(guò)雙側(cè)頸總動(dòng)脈備用。
　　3.實(shí)驗(yàn)處理與監(jiān)測(cè)
　　室溫維持在23～25℃，用小熱水袋放置

5、于大鼠軀干下并聯(lián)合調(diào)整60瓦白熾燈高度保證大鼠直腸溫度始終維持在(37.0±0.5)℃。大鼠全腦缺血時(shí)間為15 min，再灌注2h。各實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行不同處理干預(yù):S組即假手術(shù)組暴露雙側(cè)翼小孔，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，但不燒灼椎動(dòng)脈使其閉塞，也不夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈。剩余四組均燒灼雙側(cè)椎動(dòng)脈并夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈，造成全腦缺血。其中，T、R、D組為低溫組，均實(shí)施低溫處理:在全腦缺血前對(duì)大鼠進(jìn)行氣管插管，在咽喉部氣管插管旁放置棉球及吸痰管以防止誤吸，經(jīng)雙側(cè)

6、鼻腔置入20G硅膠管，深度約為20 mm，以100 ml·min-1·kg-1速度持續(xù)泵入4-5℃0.9％氯化鈉溶液對(duì)頭部實(shí)施淺低溫處理，低溫過(guò)程中使用吸引器持續(xù)吸引防止誤吸。等到海馬溫度降至(33.0±0.5)℃后，將雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎15 min，低溫維持1h后保持自然復(fù)溫。R、D組為給藥組，在全腦缺血前1h利用大鼠腦立體定位儀為R組經(jīng)左側(cè)腦室緩慢注射Rapamycin5μl(10mmol/l)，D組左側(cè)腦室注射等容量的DMSO。實(shí)驗(yàn)

7、全程監(jiān)測(cè)大鼠腦電圖（頭皮刺入電極）、心電圖（四肢皮下刺入電極）、海馬溫度（溫度探頭置入右側(cè)海馬CA1區(qū)即前囟后3.6 mm、中線右旁開3mm和皮層下2mm）以及直腸溫度。
　　4.標(biāo)本采集及檢測(cè)
　　4.1.免疫組織化學(xué)法測(cè)定腦組織中P70S6K蛋白及p-P70S6K蛋白的表達(dá)及蘇木精-伊紅(HE)染色后光鏡檢測(cè)
　　假手術(shù)組觀察2h，剩余四組再灌注2h后，每組隨機(jī)取6只大鼠進(jìn)行麻醉（10％水合氯醛腹腔注射）麻醉成功后

8、，用4％多聚甲醛迅速經(jīng)心灌流固定，固定后快速斷頭取腦并將腦組織放入4％多聚甲醛溶液中繼續(xù)固定，在4℃冰箱中保存，標(biāo)本用于免疫組織化學(xué)檢測(cè)。
　　4.2.海馬Western Blot方法檢測(cè)mTOR、p-mTOR蛋白表達(dá)
　　取每組另外6只大鼠，以10％水合氯醛（400mg/kg）麻醉完成后，快速斷頭打開顱骨取出大腦，在冰盤上謹(jǐn)慎分離出海馬組織，快速放入冷凍管暫時(shí)保存在于液氮中，之后移入-80℃的冰箱中保存準(zhǔn)備用于Wester

9、nBlot方法檢測(cè)mTOR、p-mTOR蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.五組大鼠的體重比較的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）
　　2.HE染色后光鏡觀察病理結(jié)果
　　S組:位于海馬CA1區(qū)的神經(jīng)元形態(tài)與結(jié)構(gòu)均正常。細(xì)胞胞漿豐富呈粉紅色，細(xì)胞核大而圓呈藍(lán)色，核仁明顯，細(xì)胞整體呈圓形和橢圓形并且邊界清晰。細(xì)胞排列整齊且分布均勻，未見異常細(xì)胞。I組:海馬CA1區(qū)正常神經(jīng)元形態(tài)和結(jié)構(gòu)嚴(yán)重?fù)p傷，正常細(xì)胞顯著減少，可見胞體皺

10、縮，胞漿腫脹。細(xì)胞形狀不規(guī)則，排列紊亂且分布不均。存活細(xì)胞顯著減少。T組:與I組相比，海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)和結(jié)構(gòu)的損傷程度明顯減輕。有少量細(xì)胞胞體皺縮，細(xì)胞排列稍顯紊亂，層次增多，存活細(xì)胞數(shù)目明顯增多。R組:與T組相比，海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)和結(jié)構(gòu)損傷較重，胞體皺縮變小，細(xì)胞核固縮深染，細(xì)胞形狀不規(guī)則，細(xì)胞排列不規(guī)整，存活細(xì)胞數(shù)目減少。D組:與R相比，海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)和結(jié)構(gòu)損傷程度較輕，細(xì)胞排列比較整齊，存活細(xì)胞數(shù)目明顯增多，與

11、T組相比，海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)和結(jié)構(gòu)損傷無(wú)顯著差異。
　　3.腦組織中P70S6K蛋白及p-P70S6K蛋白的比較
　　與S組比較，I組、T組、R組和D組p-P70S6K表達(dá)均增多，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與I組比較，T組、R組和D組p-P70S6K蛋白表達(dá)均增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與T組比較，R組p-P70S6K蛋白表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與D組比較，R組海馬組織中p-P7

12、0S6K蛋白表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。各組P70S6K蛋白表達(dá)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。其余組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　4.大腦海馬CA1區(qū)mTOR蛋白及p-mTOR蛋白表達(dá)的比較
　　與S組比較，I組、T組、R組和D組p-mTOR蛋白表達(dá)均增多，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與I組比較，T組、R組和D組p-mTOR蛋白表達(dá)均增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與T