內質網應激誘導大鼠肝星狀細胞凋亡的機制研究.pdf

1、肝纖維化(liver fibrosis)是多種慢性肝病發(fā)展的共同病理基礎,其發(fā)病機制的中心環(huán)節(jié)是靜止的肝星狀細胞(hepatic stellate cell,HSC)活化增殖,導致以膠原為主的細胞外基質(extracellular matrix,ECM)過度沉積。因此,促進活化的HSC凋亡是防治肝纖維化的重要手段。
　　內質網(Endoplasmic reticulum,ER)是調節(jié)蛋白質合成及合成后折疊、聚集的場所,同時也是調節(jié)

2、細胞內鈣水平的場所。內質網應激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)所誘導的細胞凋亡是近年來新被認識的一種凋亡途徑,與經典線粒體、死亡受體介導的細胞凋亡不同。ERS通過減少未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白的沉積,ERS激活促凋亡信號通路與多種疾病密切相關,但ERS在誘導活化肝星狀細胞凋亡的作用及機制尚不清楚。
　　本實驗選用大鼠肝星狀細胞系HSC-T6為研究對象,并以PDGF誘導其活化,探討ERS對HSC凋亡

3、的調控及相關機制,主要研究內容概括如下:
　　1.ERS促進活化的HSC凋亡
　　為了觀察ERS對活化的HSC凋亡的影響,給予PDGF體外誘導HSC-T6活化作為對照組,再分別給予內質網應激的誘導劑毒胡蘿卜素(Thapsigargin,TG)處理,采用流式細胞儀檢測ERS對活化的HSC凋亡的影響。結果發(fā)現,TG組的細胞凋亡率明顯高于對照組,提示ERS可能參與活化HSC的凋亡。
　　2.ERS對活化HSC分泌α-SMA和

4、Col1α1的影響
　　為了觀察ERS對活化的HSC分泌α-SMA和Col1α1的影響,給予PDGF體外誘導HSC活化作為對照組,再分別給予TG處理,采用Western blot法檢測肝纖維化標志性蛋白α-SMA、Col1α1的表達。結果發(fā)現,PDGF體外誘導HSC活化,α-SMA與Col1α1蛋白的表達明顯上調;與對照組相比,TG組α-SMA、Col1α1的表達顯著下調。提示ERS可能抑制活化HSC分泌α-SMA和Col1α1的

5、表達。
　　3.ERS誘導活化HSC凋亡的調控及部分機制的研究
　　為了觀察Ca2+對ERS誘導活化的HSC凋亡的影響,以TG誘導活化的HSC作為模型組,再分別給予鈣離子螯合劑EGTA和BAPTA/AM處理,流式細胞術檢測細胞凋亡率,采用Western blot法檢測Calpain、Capase-12、Capase-9、Capase-3和JNK/p38 MAPK蛋白的表達。結果發(fā)現,與正常組比較,TG明顯促進HSC凋亡,同時

6、發(fā)現TG能顯著促進HSC中Calpain、Capase-12、Capase-9、Capase-3和JNK/p38 MAPK蛋白的表達及活化,而給予EGTA和BAPTA/AM干預后,HSC的凋亡明顯受到抑制,Calpain、Capase-12、Capase-9、Capase-3和JNK/p38 MAPK蛋白表達及活性均受到抑制。提示ERS誘導的活化HSC凋亡機制可能與細胞內鈣離子調節(jié)Calpain、Capase-12、Capase-9、C

7、apase-3和JNK/p38 MAPK蛋白的表達有關。
　　為了進一步探討ERS誘導活化HSC凋亡的機制,分別給予Calpain抑制劑Calpeptin、Pan-Capase抑制劑z-VAD-FKM、JNK抑制劑SP600125及p38 MAPK抑制劑SB202190處理,采用流式細胞術觀察HSC凋亡率,Western blot法檢測Calpain、Capase-12、Capase-9、Capase-3和JNK/p38 MAPK

8、蛋白的表達。結果發(fā)現,與正常組比較,C-Capase-12、Capase-9和C-Capase-3的蛋白表達明顯下降,而Pan-Capase抑制劑z-VAD-FKM組Calpain的蛋白表達無明顯變化。提示ERS誘導的活化HSC凋亡機制可能與細胞內鈣離子調節(jié)Calpain、Capase-12、Capase-9、Capase-3和JNK/p38 MAPK蛋白的表達有關。
　　4.腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TNF-related

9、apoptosis inducing-ligand,TRAIL)通過ERS對活化的HSC凋亡的調控及部分機制的研究
　　前期研究結果發(fā)現:在肝纖維化逆轉恢復期,枯否細胞可以通過分泌TRAIL誘導活化HSC凋亡。為了進一步探討TRAIL與ERS誘導的活化HSC凋亡的相互關聯。體外給予PDGF刺激活化的HSC,再分別給予TRAIL與ERS誘導劑衣霉素(Tunicamycin,TN)處理,觀察各組凋亡基因Bax mRNA、Caspase

10、-3、內質網應激相關蛋白Caspase-12,CHOP,GRP78的表達。結果發(fā)現,與PDGF刺激活化的HSC的對照組相比較,TRAIL組與TN組Bax mRNA表達明顯上調、Caspase-3的活化增加,內質網應激相關蛋白Caspase-12,CHOP,GRP78的表達均明顯上調。提示ERS可能參與TRAIL調控活化的HSC凋亡。
　　以上結果提示,ERS參與活化HSC凋亡的調控,其機制可能與其釋放細胞內鈣離子,導致細胞內鈣離子