TTF1-NP誘導(dǎo)人肝癌HepG-2細(xì)胞凋亡的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激作用機制.pdf

1、目的：不同劑量 TTF1-NP分別誘導(dǎo) HepG-2，Hep3B及 Chang Liver細(xì)胞凋亡，探討 TTF1-NP對不同肝癌細(xì)胞及正常肝細(xì)胞的作用及其涉及的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激作用機制。
　　方法：通過MTT法觀察不同時間（24 h，48 h，72 h）、不同濃度（25，50，100μmol/L）的TTF1-NP對人肝癌細(xì)胞及正常肝細(xì)胞的增殖抑制作用，并選取TTF1-NP的最適干預(yù)濃度和時間；通過HE，Hoechst和AO/EB染色觀

2、察TTF1-NP誘導(dǎo)人肝癌 HepG-2細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化；利用流式細(xì)胞儀檢測人肝癌 HepG-2細(xì)胞的凋亡情況；通過Western Blot和免疫細(xì)胞化學(xué)染色技術(shù)檢測TTF1-NP誘導(dǎo)人肝癌 HepG-2細(xì)胞凋亡的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白 GRP78，CHOP，JNK，p-JNK及Caspase-4的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.MTT法檢測細(xì)胞增殖抑制結(jié)果顯示：不同濃度的TTF1-NP干預(yù)3種細(xì)胞不同時間后，3種細(xì)胞生長均

3、受到不同程度的抑制，且呈一定的濃度和時間依賴關(guān)系。其中 TTF1-NP對人肝癌 HepG-2細(xì)胞抑制最為明顯，Hep3B其次，TTF1-NP對Chang Liver細(xì)胞抑制不顯著。
　　2.形態(tài)學(xué)檢測結(jié)果顯示：（1）光學(xué)顯微鏡檢測結(jié)果（HE染色）：對照組HepG-2細(xì)胞呈梭形，細(xì)胞延展性較好，細(xì)胞核規(guī)則。隨著藥物劑量增加，細(xì)胞數(shù)減少，形態(tài)改變，細(xì)胞變圓，變小，細(xì)胞核固縮，碎裂，細(xì)胞核深染。（2）熒光顯微鏡檢測結(jié)果：AO/EB染色結(jié)

4、果顯示，對照組細(xì)胞幾乎全部呈綠色，有少量黃綠色細(xì)胞。加藥組細(xì)胞隨藥物濃度增加，細(xì)胞多染為紅色；Hoechst染色結(jié)果顯示，對照組細(xì)胞染色均勻，呈微弱均勻藍(lán)色，加藥組細(xì)胞隨用藥量增加，細(xì)胞減少，細(xì)胞核內(nèi)可見顆粒塊狀藍(lán)色熒光。
　　3.流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果：對照組細(xì)胞存活率為91.34％，凋亡率僅為4.92%。加藥組細(xì)胞隨藥物濃度增加存活率逐漸下降，凋亡率逐漸上升。100μmol/L濃度處理組細(xì)胞，凋亡率達(dá)93.79%，存活率僅為4.1

5、7%。
　　4. ERS關(guān)鍵蛋白檢測結(jié)果：Western Blot檢測結(jié)果顯示，對照組細(xì)胞內(nèi) ERS起始蛋白GRP78及ERS凋亡蛋白p-JNK及Caspase-4表達(dá)量很低，隨著藥物濃度增加，表達(dá)逐漸升高。CHOP蛋白對照組不表達(dá)，加大藥物刺激濃度CHOP蛋白表達(dá)。免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測結(jié)果與Western Blot檢測結(jié)果基本相同。
　　5.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-PBA干預(yù)結(jié)果顯示，對照及對照-4-PBA干預(yù)組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)