內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激—線粒體細(xì)胞凋亡途徑在氟中毒導(dǎo)致的HepG2細(xì)胞凋亡機(jī)制中的作用.pdf

1、目的: 為了探索內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激—線粒體細(xì)胞凋亡途徑在氟中毒導(dǎo)致的HepG2細(xì)胞凋亡機(jī)制中作用。本文檢測了經(jīng)氟化鈉處理的HepG2肝細(xì)胞中葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（Glucose-regulated protein78, GRP78）、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白94（Glucose-regulated protein94, GRP94）、CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白（CCAAT／enhancer—binding protein homologous pr

2、otein，CHOP）等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)蛋白的mRNA和蛋白表達(dá)；同時(shí)亦檢測了凋亡誘導(dǎo)因子（apoptosis-inducing factor, AIF）、B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cells lymphoma-2, Bcl-2）、與Bcl-2共沉淀的X蛋白質(zhì)（Bcl-as-sociated X protein, Bax）、細(xì)胞色素C（Cytochrome C）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate spec

3、ific proteinase, caspase)9和3等線粒體細(xì)胞凋亡途徑相關(guān)蛋白的表達(dá)，揭示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激—線粒體細(xì)胞凋亡途徑等病理因素導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡的機(jī)制。
　　方法: HepG2細(xì)胞行常規(guī)培養(yǎng)；分別選取0 mM（對照組）、0.5 mM、1 mM、2 mM、3 mM、6 mM和9 mM等不同濃度的NaF處理HepG2細(xì)胞24 h、48 h及72 h；光鏡下觀察不同濃度NaF處理HepG2細(xì)胞后細(xì)胞形態(tài)的改變；利用流式細(xì)胞分析儀檢

4、測HepG2細(xì)胞的凋亡率；MTT方法對上述濃度NaF處理下引起的線粒體功能損傷進(jìn)行檢測；實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time PCR）檢測GRP78，GRP94，CHOP和AIF在不同濃度NaF處理下mRNA的表達(dá)；免疫印跡（Western Blot）方法，從蛋白質(zhì)水平檢測GRP78、GRP94、CHOP、AIF、Bcl-2、Bax、Cytochrome C、Caspase9及Caspase3的活性改變。
　　結(jié)果: 不同濃度N

5、aF處理HepG2細(xì)胞24 h后觀察到，隨著NaF處理濃度的升高，HepG2細(xì)胞形態(tài)逐漸變得不規(guī)則，由梭形逐漸變成圓形。流式細(xì)胞分析儀檢測HepG2細(xì)胞的凋亡率，結(jié)果顯示在相同處理時(shí)間下，細(xì)胞凋亡率與NaF處理濃度呈正相關(guān)，且在2 mM NaF處理24 h后，HepG2細(xì)胞凋亡率明顯增加。在上述條件下，MTT檢測NaF對HepG2細(xì)胞產(chǎn)生的毒性作用，結(jié)果表明細(xì)胞毒性表現(xiàn)在相同處理時(shí)間下與NaF處理濃度呈正相關(guān)，且在2 mM NaF處理2

6、4 h后，細(xì)胞毒性明顯增加。用Real-time PCR和 Western Blot方法檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)蛋白GRP78、GRP94和CHOP的mRNA和蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示3 mM NaF處理HepG2細(xì)胞24 h后，GRP78和CHOP的mRNA和蛋白表達(dá)水平較對照組明顯升高；而GRP94的mRNA較對照組明顯升高，蛋白水平較對照組下降。同時(shí)，線粒體凋亡蛋白AIF的mRNA和蛋白表達(dá)水平較對照組明顯升高。Western Blot方

7、法檢測到3 mM NaF處理細(xì)胞24 h，線粒體細(xì)胞凋亡途徑相關(guān)蛋白Bcl-2、Cytochrome C、Caspase9、Caspase3蛋白在胞漿中的表達(dá)較對照組明顯升高；而Bax則較對照組明顯降低。
　　結(jié)論: 在HepG2肝細(xì)胞氟中毒模型中，通過檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)蛋白GRP78、GRP94和CHOP的mRNA以及蛋白表達(dá)水平，觀察到HepG2細(xì)胞在NaF處理下發(fā)生了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)；通過檢測AIF、Bcl-2、Bax、Cyt