氧化應激偶聯(lián)內質網(wǎng)應激在氟中毒大鼠生殖損傷中的作用及機制.pdf

1、氟中毒是一種嚴重危害人類健康的全身性疾病。過量氟暴露可引起機體慢性、潛在性危害。尤其是氟暴露對生殖系統(tǒng)的影響，目前已受到國內外相關學者的廣泛關注。氟是一種電負性元素，化學性質極其活潑，其可直接攻擊氧，干擾氧代謝造成活性氧（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生過多。近年來大量研究發(fā)現(xiàn)，氟中毒對細胞或組織的損傷作用可能是通過氧化應激而導致的。內質網(wǎng)應激（endoplasmic reticulum stress，ERS

2、）是指細胞受到內外因素刺激時，內質網(wǎng)腔中錯誤折疊和未折疊蛋白質過度蓄積，進而促發(fā)未折疊蛋白反應（unfolded protein response，UPR）。有研究發(fā)現(xiàn)，ERS可能與氟骨癥及氟斑牙的發(fā)病過程密切相關。然而，ERS是否參與氟中毒生殖損傷機制，尚不清楚。另外，有學者發(fā)現(xiàn)，ROS可作用于內質網(wǎng)，導致ERS持續(xù)進行性激活，氧化應激可能介導了ERS信號通路。
　　鑒于氧化應激和內質網(wǎng)應激在氟中毒發(fā)生過程中不可忽視的作用，且R

3、OS/氧化應激與內質網(wǎng)應激之間存在不可分割的內在聯(lián)系。本研究擬通過建立氟中毒動物模型與染氟細胞模型相結合的方式，首先觀察氟中毒雄性大鼠的生殖損傷相關效應，檢測機體內氧化應激水平，分析氧化應激在氟致生殖損傷中的可能作用機制；觀察ERS促發(fā)未折疊蛋白級聯(lián)反應中標志性信號分子在損傷中的變化，進一步分析氧化應激介導的ERS效應及其結局，探討以上生物事件發(fā)生的關聯(lián)。同時結合體外實驗，用抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine,

4、NAC）和小分子干擾RNA（smalll interfering RNA,siRNA）技術對上述關聯(lián)加以驗證。
　　目的:
　　本研究擬通過體內實驗和體外實驗相結合的方法，探討氟致生殖損傷中的氧化應激和內質網(wǎng)應激狀態(tài)，以此綜合評價氟對生殖損傷的影響及其與氧化-內質網(wǎng)應激的關聯(lián)，為闡明氟中毒生殖損傷可能形成機制提供新的思路。
　　方法:
　　1.實驗動物處理及分組
　　4周齡健康雄性Sprague-Dawle

5、y（SD）大鼠60只。將大鼠稱重編號后隨機分為4組，每組15只，即對照組；氟化鈉（NaF）組；NAC組；NaF和NAC聯(lián)合作用組。對照組給予0.9％氯化鈉溶液；NaF組、NAC組及NaF+NAC組采用的劑量和試劑分別為：25mg/kgBw?d NaF溶液、150mg/kgBw?d NAC溶液和（25 mg/kgBw?d NaF+150mg/kgBw?d NAC）溶液，各處理組采用灌胃的方式染毒，染毒時間為7周。
　　2.氟暴露致機

6、體生殖損傷效應相關指標檢測
　　染毒7周后，稱重、麻醉抽取腹主動脈血并處死大鼠，立即解剖取睪丸、附睪，稱重并計算臟器系數(shù)，進行精子密度、精子活動率和精子畸形率的測定；采用氟離子選擇電極法測定睪丸中氟的含量；酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測血清睪酮含量；睪丸組織HE染色鏡檢；TUNEL法檢測睪丸組織細胞凋亡。
　　3.睪丸組織中氧化應激水平檢測
　　采用生化方法檢測各處理組大鼠睪丸組織丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧

7、化酶（SOD）活力及谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活力。
　　4.睪丸組織中內質網(wǎng)應激相關指標檢測
　　Western blot檢測各處理組大鼠睪丸組織中GRP78、PERK、eIF2α、p-eIF2α及CHOP蛋白表達水平。
　　5.細胞處理及分組
　　16~20日齡健康雄性SD大鼠，對睪丸支持細胞進行分離、培養(yǎng)、純化以及鑒定。提取的原代細胞用含10%胎牛血清的 DMEM/F12培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO

8、2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。根據(jù) NaF和 NAC單獨或聯(lián)合作用的方式，分為以下8組：0μg/ml NaF（對照組）、6μg/ml NaF組、12μg/ml NaF組、24μg/ml NaF組、2 mmol/L NAC組、6μg/ml NaF+2 mmol/L NAC組、12μg/ml NaF+2 mmol/L NAC組和24μg/ml NaF+2 mmol/L NAC組，各組加入相應藥物培養(yǎng)24 h。
　　6.睪丸支持細胞存活率及凋亡相

9、關指標檢測
　　MTT法檢測各處理組的細胞活性；采用脂溶性熒光探針JC-1檢測細胞線粒體膜電位下降水平；采用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡水平。
　　7.睪丸支持細胞氧化應激水平和Nrf2核轉位情況
　　采用熒光探針DCFH-DA檢測細胞中活性氧（ROS）含量；生化方法檢測細胞內MDA及SOD水平；Western blot測定Nrf2胞漿和胞核蛋白表達，觀察細胞內Nrf2核轉位情況。
　　8

10、.睪丸支持細胞內質網(wǎng)應激相關指標檢測
　　Western blot法測定各處理組睪丸支持細胞的GRP78、PERK、eIF2α、p-eIF2α和CHOP的蛋白表達。
　　9. siRNA技術沉默CHOP
　　采用riboFECT? CP轉染試劑將設計合成的CHOP-siRNA及陰性對照siRNA轉染至睪丸支持細胞，實時定量PCR和Western blot分別檢測轉染后的CHOP mRNA和蛋白表達情況，以驗證轉染效率，

11、最后采用AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測CHOP沉默后的細胞凋亡率變化。
　　結果:
　　1.分析大鼠體重、睪丸和附睪重量及其臟器系數(shù)，結果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比， NaF組的體重、睪丸和附睪重量均降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；分析大鼠精子質量，結果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，NaF組的精子密度和精子存活率降低，而精子畸形率升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與 NaF組相比，NAC聯(lián)合作用組的精子密度和精子存活

12、率升高，而精子畸形率降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；檢測睪丸氟含量，結果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，NaF組及 NAC聯(lián)合作用組的睪丸氟含量升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；檢測血清睪酮含量，結果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，NaF組及NAC聯(lián)合作用組的睪酮含量降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與 NaF組相比，NAC聯(lián)合作用組的睪酮含量升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　2.睪丸組織HE染色的鏡檢結果顯示，對照組和N

13、AC組的生精上皮細胞形態(tài)結構完整且無脫落細胞，可見大量成熟精子；NaF組的生精細胞間結構疏松，生精細胞數(shù)量減少，管腔中有脫落的精子和組織；與NAC聯(lián)合作用后，生精細胞結構基本完整，管腔脫落細胞減少。
　　3. TUNEL法檢測睪丸組織細胞凋亡情況，結果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，NaF組細胞凋亡率顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與NaF組相比，NAC聯(lián)合作用組細胞凋亡水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
　　4.

14、檢測睪丸組織氧化應激水平，結果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，NaF組MDA含量增高，而SOD和GSH-Px活力降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與NaF組相比，NAC聯(lián)合作用組的MDA含量降低，而GSH-Px活力升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
　　5.檢測睪丸組織中內質網(wǎng)應激相關蛋白表達情況，結果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，氟暴露上調了GRP78、PERK、p-eIF2α和CHOP蛋白表達水平，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，而N

15、AC抑制了GRP78和CHOP蛋白表達的上調，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
　　6.檢測睪丸支持細胞存活率及凋亡情況，結果發(fā)現(xiàn)，12μg/ml和24μg/mlNaF處理組的細胞存活率下降，各 NaF處理組的線粒體膜電位水平顯著降低且細胞凋亡率顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。NAC提高了細胞存活率、削弱線粒體膜電位的下降，并減少了細胞凋亡的發(fā)生，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
　　7.檢測睪丸組織中氧化應

16、激水平和Nrf2核轉位情況，結果顯示，與對照組相比，各 NaF處理顯著提高了睪丸支持細胞內的 ROS水平且降低了 SOD活力，12μg/ml和24μg/ml NaF組MDA含量顯著上升，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。隨著NaF劑量的增高，各NaF組的Nrf2胞漿蛋白表達依次明顯下調，而Nrf2胞核蛋白表達依次明顯上調，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。NAC顯著拮抗了細胞氧化應激的效應，并促進Nrf2核轉位，差異有統(tǒng)計學意義(P<0

17、.05)。
　　8.檢測睪丸支持細胞內質網(wǎng)應激相關蛋白表達情況，結果顯示，各NaF處理組的GRP78蛋白表達顯著上調，12μg/ml和24μg/ml NaF組的PERK、p-eIF2α和CHOP蛋白表達顯著上調，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。NAC在不同程度上拮抗了相關蛋白的表達，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
　　9.采用siRNA技術有效沉默了CHOP的mRNA和蛋白表達，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，沉默C