內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在利福平誘導(dǎo)的藥物性肝損傷中的作用和機(jī)制研究.pdf

1、利福平是一種一線抗結(jié)核藥物，其引起的肝細(xì)胞毒性是一個(gè)重要的臨床問題。目前對(duì)于利福平引起肝細(xì)胞損傷的具體機(jī)制還知之甚少。本文在體外條件下觀察了利福平引起L02細(xì)胞、HepG2細(xì)胞損傷及其演變過程，從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激角度觀察了利福平對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白和膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體相關(guān)蛋白表達(dá)、蛋白定位及基因表達(dá)的影響，運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)觀察了CHOP基因、Nrf2基因沉默及過表達(dá)對(duì)利福平誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的影響，以及采用藥物4-苯基丁酸（4-PBA）干預(yù)的方法，初步

2、探討了利福平致肝細(xì)胞損傷的分子機(jī)制。
　　1.利福平誘導(dǎo)L02細(xì)胞毒性損害研究
　　為研究利福平誘導(dǎo)L02細(xì)胞損傷的劑量-效應(yīng)和時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系，不同劑量的利福平（100μM，200μM，300μM，400μM）給藥不同時(shí)間（12 h，24 h，36 h，48 h）后，倒置顯微鏡下觀察L02細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率變化，MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率變化，ELISA及微板法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中ALT、AST、AKP、LD

3、H和ATP水平等方法，觀察利福平的細(xì)胞毒性。
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常 L02細(xì)胞呈單層貼壁生長(zhǎng)，形態(tài)與類上皮樣細(xì)胞相似。給予利福平后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，并且隨著利福平劑量增加及給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)改變愈加明顯，細(xì)胞變成長(zhǎng)梭形甚至形態(tài)不均，貼壁細(xì)胞數(shù)量減少，漂浮細(xì)胞增多，可有細(xì)胞碎片出現(xiàn)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率發(fā)現(xiàn)隨著利福平作用濃度增加及作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞凋亡率逐漸升高，200μM、300μM、400μM利福平給藥12 h即可引起

4、細(xì)胞凋亡率增加，400μM利福平給藥48 h幾乎導(dǎo)致所有細(xì)胞發(fā)生凋亡。MTT結(jié)果顯示細(xì)胞存活率呈逐漸下降，與細(xì)胞凋亡率趨勢(shì)相反。當(dāng)利福平劑量超過100μM細(xì)胞存活率明顯抑制，當(dāng)作用時(shí)間超過24 h，四個(gè)劑量對(duì)細(xì)胞活力都有明顯的影響。利福平24 h的IC50值是548.91μM，48 h IC50大約是234.96μM。同時(shí)，200μM利福平給藥48 h細(xì)胞培養(yǎng)上清中ALT、AST、AKP、LDH和ATP水平均明顯升高。
　　2.利

5、福平激活L02細(xì)胞PERK-ATF4-CHOP通路的研究
　　為探討利福平誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡反應(yīng)，100μM、200μM利福平給藥48 h，觀察其對(duì)GRP78、PERK、ATF4、CHOP蛋白表達(dá)及基因表達(dá)的影響。200μM增加了GRP78、PERK和ATF4的蛋白表達(dá)，而對(duì)CHOP蛋白表達(dá)未見明顯影響。在基因水平，200μM利福平增加了GRP78、PERK、ATF4及CHOP的基因表達(dá)水平。100μM利福平?jīng)]有明顯的刺激作用。這表明

6、利福平可以在蛋白和基因水平上激活PERK-ATF4-CHOP通路，并且具有劑量依賴性。
　　接下來(lái)我們觀察了200μM利福平治療12 h、24 h及48 h對(duì)PERK-ATF4-CHOP通路的影響。結(jié)果顯示12 h、24 h蛋白水平無(wú)變化，48 h時(shí)GRP78、PERK和ATF4的蛋白表達(dá)增加。在基因水平，利福平治療12 h ATF4及CHOP表達(dá)增加，24 h時(shí)GRP78、ATF4及CHOP表達(dá)增加，而48h時(shí)整個(gè)通路被激活。這

7、表明利福平激活PERK-ATF4-CHOP通路具有時(shí)間依賴性。
　　3. CHOP基因在利福平誘導(dǎo)L02細(xì)胞凋亡中的作用
　　我們通過轉(zhuǎn)染CHOP-siRNA來(lái)觀察CHOP基因沉默后對(duì)利福平誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響?；虺聊释ㄟ^qRT-PCR和western blot檢測(cè)。與轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA組相比，CHOP基因表達(dá)減少了約70%，CHOP蛋白表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化。有趣的是，CHOP基因沉默后再給予利福平治療，在蛋白水平

8、，GRP78、PERK、ATF4的表達(dá)均減少；在基因水平，CHOP、GRP78、PERK以及ATF4的表達(dá)均減少。同時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的凋亡率下降，細(xì)胞的存活率升高，細(xì)胞培養(yǎng)上清中LDH水平也下降。
　　我們通過轉(zhuǎn)染CHOP過表達(dá)質(zhì)粒來(lái)觀察CHOP基因過表達(dá)后對(duì)利福平誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響。同樣，基因表達(dá)效率通過qRT-PCR和western blot檢測(cè)。與轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒組相比，CHOP基因表達(dá)的水平增加了243倍，CHOP蛋白表達(dá)增加

9、了17倍，CHOP基因過表達(dá)后再給予利福平治療，在蛋白水平，GRP78、PERK、ATF4的表達(dá)未發(fā)生顯著改變；在基因水平，GRP78的表達(dá)明顯增加。同時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的凋亡率增加，細(xì)胞的存活率降低，以及上清中LDH水平上升。
　　4.4-PBA抑制利福平誘導(dǎo)的L02細(xì)胞PERK-ATF4-CHOP通路的激活
　　經(jīng)4-PBA治療后，利福平誘導(dǎo)的GRP78、PERK及 ATF4蛋白表達(dá)降低，CHOP、JNK、p-JNK蛋白表達(dá)無(wú)明

10、顯改變。GRP78、PERK、ATF4及 CHOP的基因表達(dá)水平均顯著降低。免疫熒光分析表明 GRP78、PERK及 ATF4的熒光強(qiáng)度降低，CHOP熒光強(qiáng)度無(wú)明顯改變。表明4-PBA可以在蛋白水平和基因水平抑制利福平誘導(dǎo)的PERK-ATF4-CHOP通路的激活。
　　5.4-PBA對(duì)L02細(xì)胞的保護(hù)作用
　　利福平能導(dǎo)致明顯的細(xì)胞凋亡，經(jīng)4-PBA治療后細(xì)胞的凋亡率出現(xiàn)下降。MTT結(jié)果顯示經(jīng)4-PBA治療后，4-PBA+利

11、福平組細(xì)胞存活率較利福平組升高。4-PBA治療后，ALT、AST、AKP、LDH及ATP水平均下降。
　　6.利福平誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞毒性損害研究
　　為研究利福平誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞損傷的效應(yīng)，不同劑量的利福平（100μM，200μM，300μM，400μM）給藥不同時(shí)間（24 h，48 h）后，倒置顯微鏡下觀察HepG2細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率變化，ELISA及微板法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中LDH、ALT、AST、

12、AKP、γ-GT、TBIL、DBIL、IBIL、TBA及ATP水平等方法，觀察利福平的細(xì)胞毒性。
　　倒置顯微鏡下，正常的HepG2細(xì)胞形態(tài)似上皮細(xì)胞樣，細(xì)胞間相互連接，密集成片生長(zhǎng)，胞漿內(nèi)未見透明顆粒。給予利福平后，隨著利福平作用濃度增加及作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞也變成長(zhǎng)梭形甚至形態(tài)不均，貼壁細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞散在生長(zhǎng)，漂浮細(xì)胞明顯增多，折光加強(qiáng)。MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)隨著利福平作用濃度增加及作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率逐漸下降，同時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)

13、上清中LDH、ALT、AST、AKP、γ-GT、TBIL、DBIL、IBIL、TBA及 ATP的水平逐漸升高，呈現(xiàn)出一定的劑量效應(yīng)和時(shí)間效應(yīng)。利福平24 h的IC50值是550.50μM，48 h IC50大約是311.01μM。
　　7.利福平激活HepG2細(xì)胞膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體及Nrf2表達(dá)的研究
　　為探討利福平誘導(dǎo)膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激適應(yīng)性反應(yīng)因子Nrf2的表達(dá)，不同劑量的利福平給藥不同時(shí)間后，觀察其對(duì)膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體和N

14、rf2蛋白表達(dá)及基因表達(dá)的影響。在24 h，BSEP、MDR1、總Nrf2及胞核Nrf2的蛋白表達(dá)有不同程度增加。NTCP和胞漿Nrf2蛋白表達(dá)有不同程度減少。BSEP、MRP2、NTCP、OATP2、OSTβ、總Nrf2的基因表達(dá)有不同程度增加。
　　在48 h，BSEP、MDR1、MRP2、NTCP、OATP2、OSTβ及總Nrf2的蛋白表達(dá)和基因表達(dá)均有不同程度增加。胞漿Nrf2蛋白表達(dá)有不同程度減少，胞核Nrf2的蛋白表達(dá)

15、有不同程度增加。
　　8. Nrf2基因在利福平誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)中的作用
　　我們通過轉(zhuǎn)染Nrf2-siRNA及Nrf2過表達(dá)質(zhì)粒來(lái)觀察Nrf2基因?qū)Ｆ秸T導(dǎo)HepG2細(xì)胞膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)的影響?；虺聊释ㄟ^qRT-PCR和western blot檢測(cè)。與轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA組相比，Nrf2基因表達(dá)減少了90%，總Nrf2蛋白、胞漿Nrf2蛋白表達(dá)減少了50%，胞核Nrf2蛋白表達(dá)減少了70%。Nr

16、f2基因沉默后再給予300μM利福平治療48 h，BSEP、MDR1、MRP2、NTCP、OATP2、OSTβ的蛋白及基因表達(dá)都有不同程度減少。細(xì)胞的存活率下降，細(xì)胞培養(yǎng)上清LDH水平上升。
　　轉(zhuǎn)染了過表達(dá)質(zhì)粒后，與轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒相比，Nrf2基因表達(dá)增加了50倍，總Nrf2蛋白、胞漿Nrf2蛋白表達(dá)增加了2倍，胞核Nrf2蛋白表達(dá)增加了5倍。Nrf2基因過表達(dá)后再給予利福平治療，膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)均增加。同時(shí)細(xì)胞的存活率上升，細(xì)

17、胞培養(yǎng)上清LDH水平下降。
　　根據(jù)以上研究結(jié)果，本文得出以下結(jié)論：（1）利福平能夠激活PERK-ATF4-CHOP通路，這與其誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷密切相關(guān)，并且CHOP是利福平誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用靶點(diǎn)之一；（2）內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-PBA能夠抑制利福平誘導(dǎo)的PERK-ATF4-CHOP通路蛋白表達(dá)和基因表達(dá)，抑制L02細(xì)胞凋亡，增加細(xì)胞存活率，降低細(xì)胞損傷標(biāo)志物的水平，因此具有細(xì)胞保護(hù)作用；（3）Nrf2介導(dǎo)了利福平誘導(dǎo)的膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體適