內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激在尿毒癥血清誘導內(nèi)皮細胞功能損傷中的作用.pdf

1、背景：
　　 心血管疾病(CVD)是終末期腎病(ESRD)患者常見的并發(fā)癥和最主要的死亡原因。
　　 已經(jīng)證實尿毒癥加速性動脈粥樣硬化是最危險的因素。與普通人群相比，尿毒癥并發(fā)動脈粥樣硬化具有發(fā)病年齡早、發(fā)病率高、病變累積廣泛等特點。傳統(tǒng)的危險因素如：
　　 高血壓、糖尿病、血脂代謝紊亂等雖在慢性腎衰病人中也較為普遍，但并不能滿意解釋尿毒癥患者如此高的加速性動脈粥樣硬化發(fā)病率和死亡率，因此推測，尿毒癥患者存在某些

2、特殊致動脈粥樣硬化(AS)因子。現(xiàn)已明確AS 實質(zhì)是血管壁細胞的慢性增殖性炎癥反應，即致AS 危險因子首先導致內(nèi)皮細胞功能損傷，表現(xiàn)為內(nèi)皮依賴的舒張功能下降，炎癥信號激活和表達炎癥細胞因子等。
　　 ERSD患者體內(nèi)嚴重的代謝紊亂，存在多種毒素，如氧化應激產(chǎn)物、各種終末糖基化產(chǎn)物和各種炎癥介質(zhì)等，它們與內(nèi)皮細胞相接觸，可通過破壞細胞結(jié)構(gòu)和功能直接損傷內(nèi)皮細胞，同時還可以刺激內(nèi)皮細胞分泌多種炎癥因子、生長因子、粘附分子，誘發(fā)持續(xù)的

3、微炎癥狀態(tài)。同時，這些活化細胞因子又可以介導炎性細胞的浸潤，進一步釋放多種炎癥因子，從而發(fā)揮正反饋效應，使血管內(nèi)皮細胞的損傷進一步加劇。如此的惡性循環(huán)必然導致AS的發(fā)生。
　　 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(ERS)作為細胞漿信號網(wǎng)絡調(diào)節(jié)的整合器，可以通過與氧化應激、泛素-蛋白酶體途徑(UPP)以及炎癥反應等信號途徑相偶聯(lián)，參與心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)紊亂、癌癥等的發(fā)生與發(fā)展。從理論上講，通過調(diào)控ERS 這一炎癥反應的中樞環(huán)節(jié)的激活對于防治細胞功能損

4、傷有著重要的臨床意義。但是，ERS是細胞的自我保護機制，在維持機體的防御功能和細胞死亡平衡方面有著重要的作用，完全阻斷又會導致免疫功能缺陷。因此適度的調(diào)控ERS，并且有針對性的特異性阻斷，可能成為控制尿毒癥加速性動脈粥樣硬化新思路。
　　 近年研究發(fā)現(xiàn)，分子伴侶是一種存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中非常重要的蛋白，具有促進和監(jiān)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的一些重要功能，如新生多肽鏈的易位、分泌蛋白的折疊和組裝、監(jiān)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的運作、識別未折疊和錯誤折疊的蛋白以及定位那些

5、待降解的蛋白以穩(wěn)定蛋白構(gòu)象，促進蛋白折疊，調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的作用，它的這些特點為我們調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞ERS的活化，減輕組織細胞損傷提供了理論依據(jù)。
　　 目的：
　　 本課題通過將人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)與尿毒癥血清共培養(yǎng)模擬ERSD內(nèi)環(huán)境來觀察經(jīng)尿毒癥血清孵育后細胞增殖能力、ERS 活性以及炎癥細胞因子的變化規(guī)律，探討ERS信號通路的活化在尿毒癥血清致內(nèi)皮細胞炎癥激活中的作用，并分析通過小分子伴侶4-苯基丁酸(4

6、-PBA)干預ERS對血管內(nèi)皮細胞炎癥增殖反應的影響，為臨床有效防治尿毒癥加速性動脈粥樣硬化提供理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.將細胞分為正常血清組(H)、尿毒癥血清組(U)以及4-PBA 干預組(4-PBA)，分別用不同濃度的尿毒癥患者血清(2.5％、5％、10％、15％、20％)或正常血清(2.5％、5％、10％、15％、20％)或含有5mM的4-PBA 刺激。
　　 2.應用HE 染色觀察HUVECs的

7、形態(tài)。
　　 3.應用MTT、流式細胞技術(shù)檢測細胞增殖。
　　 4.Hoechst 33342 染色檢測細胞凋亡。
　　 5.應用熒光定量PCR 方法檢測各組內(nèi)皮細胞分泌GRP78、MCP-1、NF-κ B、P 21、VEGF的mRNA表達水平。
　　 6.應用ELISA 方法檢測各組內(nèi)皮細胞上清液中MCP-1、VEGF的濃度。
　　 7.Western blot 檢測各組內(nèi)皮細胞GRP78、MC

8、P-1、NF-κ B、P 21蛋白表達的變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.尿毒癥血清對細胞增殖能力的影響與同濃度的正常血清組相比，2.5％～10％的尿毒癥血清能使細胞吸光度和S 期細胞的比例呈濃度依賴性顯著上升，細胞P 21mRNA的表達降低(均P<0.05)；隨著濃度的繼續(xù)增加，吸光度和S 期細胞的比例逐漸下降，而P 21的表達則轉(zhuǎn)向升高，熒光染色發(fā)現(xiàn)大量凋亡細胞，提示尿毒癥血清在低濃度時(≤10％)呈濃度依賴性促進血管

9、內(nèi)皮細胞增殖，但是較高濃度(>10％)時促增殖作用減弱，伴隨促凋亡作用增強。
　　 2.尿毒癥血清誘導內(nèi)皮細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激作用與正常血清組相比，2.5％、5％、10％的尿毒癥血清刺激內(nèi)皮細胞24h，GRP78的表達顯著增加，且隨濃度的增加有進行性升高的趨勢，提示ERS在尿毒癥血清誘導的HUVECs中顯著激活，且其強度隨著尿毒癥血清濃度的增加進行性增強。
　　 3.尿毒癥血清對內(nèi)皮細胞炎癥信號激活和炎癥因子表達的影響(1)正

10、常血清組：與無血清組相比，10％正常血清刺激HUVECs后可以檢測出少量的NF-κ B、VEGF和MCP-1，兩者相比無明顯統(tǒng)計學差異。
　　 (2)尿毒癥血清組：與正常血清組相比，10％尿毒癥血清能使內(nèi)皮細胞NF-κ B、VEGF和MCP-1的mRNA和蛋白表達顯著升高(均P<0.05)，提示尿毒癥血清引起了血管內(nèi)皮細胞炎癥信號的激活，炎癥因子表達上調(diào)。
　　 4.分子伴侶抑制尿毒癥血清刺激細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(1)尿毒癥血

11、清組：與正常血清組相比較，尿毒癥血清刺激2h、6h、12h 均能使內(nèi)皮細胞GRP78 mRNA的表達上調(diào)，GRP78蛋白的表達增加(均P<0.05)，且隨時間的延長呈進行性升高趨勢。
　　 (2)4-PBA 干預組:與尿毒癥血清組相比較，4-PBA 治療6h后GRP78 mRNA和蛋白的表達顯著下降(P<0.05)，治療12h后進一步降低，與正常血清組相比已無明顯差別，提示4-PBA能有效地減輕尿毒癥血清引起的ERS。
　

12、　 5.分子伴侶抑制尿毒癥血清誘導的內(nèi)皮細胞炎癥信號激活及炎癥因子的表達(1)尿毒癥血清組：與正常血清組相比較，在第2、6、12h 末，尿毒癥血清組NF-κ B、MCP-1和VEGF的表達均顯著升高(均P<0.05)，且隨時間的延長呈進行性升高趨勢。
　　 (2)4-PBA 干預組:與尿毒癥血清組相比較，4-PBA 治療2h NF-κ B、MCP-1和VEGF的表達無明顯差異，但是作用6h能顯著降低NF-κ B、MCP-1和V

13、EGF的表達(均P<0.05)，治療12h后進一步降低，這些結(jié)果提示4-PBA能有效地減輕尿毒癥血清引起的炎癥信號的激活和炎癥因子的表達。
　　 6.分子伴侶抑制尿毒癥血清刺激的細胞增殖(1)尿毒癥血清組：與正常血清組相比較，尿毒癥血清刺激2h、6h、12h后細胞吸光度和S 期細胞的比例顯著增加(均P<0.05)，且隨著時間的進展進一步升高；而細胞P 21mRNA表達卻顯著降低(P<0.05)。
　　 (2)4-PBA

14、干預組:與尿毒癥血清組相比較，4-PBA 治療6h和12h，吸光度和S 期細胞的比例升高幅度有了明顯的減弱，而P 21mRNA的表達下降的幅度也受到了顯著抑制(P<0.05)，表明4-PBA能有效地減輕尿毒癥血清引起的細胞異常增殖，恢復細胞活性的作用。
　　 結(jié)論：
　　 1．ERS是介導尿毒癥血清損傷內(nèi)皮細胞功能的重要分子機制。
　　 2．分子伴侶4-PBA 可通過調(diào)控ERS 抑制尿毒癥血清誘導的內(nèi)皮細胞功能損