ICA對H2O2誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損傷的拮抗作用及機(jī)制.pdf

1、隨著氧化應(yīng)激在動脈粥樣硬化、心肌缺血/再灌注損傷、心肌病、心力衰竭等多種心血管疾病(Cardiovascular disease,CVD)發(fā)生發(fā)展的作用及分子機(jī)制的日益明確,其在CVD的作用越來越受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。而血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷與凋亡是 CVD的始動因素之一,當(dāng)氧化應(yīng)激的副產(chǎn)物活性氧攻擊血管內(nèi)皮細(xì)胞時,易產(chǎn)生多種有害物質(zhì)妨礙蛋白質(zhì)分子正常翻譯,造成蛋白質(zhì)無法保持應(yīng)有的折疊結(jié)構(gòu)而失活;過多的未折疊蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)沉積,即啟動內(nèi)

2、質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（Endoplasmic reticulum stress,ERS),當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)無法處理這些蛋白時,即促使內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入凋亡途徑。因此,研究藥物拮抗氧化應(yīng)激引起的ERS損傷的作用,對CVD的防治具有重要的意義。
　　淫羊藿苷（Icarlin,ICA)是淫羊藿干燥莖葉中提取出的黃酮類物質(zhì),具有抗氧化損傷、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞,抗心肌缺血,防治心血管疾病的作用。ICA能夠拮抗同型半胱氨酸（Homocysteine,HCY)誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

3、和高糖引起的氧化應(yīng)激損傷,增加損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞中超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD)活性,減少乳酸脫氫酶（Lactate dehydrogenase,LDH)活性和丙二醛（Malondialdehyde,MDA)含量;同時,降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志蛋白葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose regulated protein,GRP78)的mRNA表達(dá)。提示 ICA對氧化應(yīng)激損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用可能與減輕

4、ERS損傷有關(guān)。但是,ICA對正常血管內(nèi)皮細(xì)胞活力的影響,及對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志蛋白,如轉(zhuǎn)錄激活因子6(activaing transcription factor-6,ATF6)和真核起始因子2α(Eukaryotic initiation factor2α,eIF2α)的作用,未見報道。為了進(jìn)一步探討 ICA拮抗血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的作用及其與 ERS的關(guān)系,我們觀察過氧化氫（Hydrogen peroxide,H2O2)處理的人

5、臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（Human umbilical vein endothelial cell,HUVECs)后,ICA對細(xì)胞活力和凋亡的、相關(guān)酶學(xué)指標(biāo),及GRP78、ATF4、eIF2ɑ蛋白表達(dá)的影響。
　　第一部分 ICA對正常血管內(nèi)皮細(xì)胞活力的影響
　　目的:觀察不同濃度ICA,在不同時間對正常 HUVECs活力的影響。
　　方法:對50μM、75μM、100μM的ICA和溶解液(DMSO)處理正常 HUVECs,并

6、于24 h、48 h、72h,采用CCK-8法檢測細(xì)胞活力。
　　結(jié)果:濃度為50μM、75μM、100μM的ICA和溶解液(DMSO)干預(yù)正常 HUVECs后,分別在24 h、48 h、72 h測得的OD值,與對照組相比無顯著性差異(P>0.05)。
　　結(jié)論:50μM、75μM、100μM的ICA對正常 HUVECs活力無明顯影響。
　　第二部分 ICA對 H2O2誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的拮抗作用
　

7、　目的:觀察ICA拮抗H2O2處理的HUVECs損傷后,細(xì)胞形態(tài)、凋亡及相關(guān)酶學(xué)指標(biāo)的影響。
　　方法:隨機(jī)將 HUVECs為5組:對照組、H2O2組及 H2O2+50μM ICA、H2O2+75μM ICA和H2O2+100μM ICA組。采用 CCK-8法檢測不同實驗組的細(xì)胞活力,MTT法測定細(xì)胞貼附能力,TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡,分光光度法和ELISA檢測SOD、GSH-Px和LDH活性及 MDA含量。
　　結(jié)果:H2

8、O2處理后,細(xì)胞活力和粘附能力減弱,而凋亡增加;不同濃度的ICA均可一定程度上,增加細(xì)胞活力和粘附能力和減輕凋亡,及提高SOD和GSH-Px的活性,降低 LDH活性和MDA含量;其中,H2O2+100μM ICA組較 H2O2組有顯著性差異(P<0.01)。
　　結(jié)論:ICA可拮抗 H2O2誘導(dǎo)的對血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷,且呈明顯的量效關(guān)系,其中,ICA濃度為100μM時,拮抗作用最為明顯。
　　第三部分 ERS在ICA拮抗血管

9、內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷中的作用
　　目的:探討 ERS在 ICA拮抗 H2O2誘導(dǎo)的HUVECs氧化應(yīng)激損傷中的作用。
　　方法:1.將 HUVECs分為3組:對照組、H2O2組、H2O2+100μM ICA組。采用 Western blotting檢測 HUVECs的GRP78、ATF4、eIF2ɑ蛋白表達(dá)。2.將HUVECs分為4組:H2O2組、H2O2+ICA組、H2O2+ICA+4-PBA組、H2O2+4-PBA組;3

10、.將HUVECs分為4組: H2O2組、H2O2+ICA組、H2O2+ICA+DTT組、H2O2+DTT組。分別采用 CCK-8法、Western blotting和分光光度法和ELISA檢測細(xì)胞活力、SOD和GSH-Px活性及 GRP78、ATF4、eIF2ɑ蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:H2O2或 DTT可明顯增加 GRP78、ATF4、eIF2ɑ蛋白的表達(dá),減弱細(xì)胞活力(P<0.01)。而給予100μM ICA和4-PBA干預(yù),則可

11、顯著抑制GRP78、ATF4、eIF2ɑ的蛋白表達(dá),且增加細(xì)胞活力(P<0.01);如同時給予ICA和4-PBA時,這種抑制作用更加明顯(P<0.01)。
　　結(jié)論:ICA可能通過抑制 GRP78、ATF4、eIF2ɑ的表達(dá),拮抗氧化應(yīng)激對血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。至于同時給予ICA和4-PBA干預(yù)后GRP78、ATF4、eIF2ɑ的蛋白表達(dá)比單用 ICA或4-PBA顯著降低,且細(xì)胞活力明顯增加,可能與ICA和4-PBA的疊加效應(yīng)有關(guān)。