內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在高血壓血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的作用研究.pdf

1、研究目的為探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERStress)在高血壓導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的作用,本實驗通過培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(humanumbiliealveinendothelialcells,HUVECs),不同濃度血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)持續(xù)刺激24小時模擬高血壓狀態(tài),MTT法檢測細(xì)胞的凋亡率,透射電鏡觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的形態(tài)學(xué)改變,免疫熒光化學(xué)和western-blotting法檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERStress)標(biāo)記蛋白PERK、IRE1α、BiP、E

2、ro1-Lα及PDI在內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá);為進(jìn)一步證實ERStress在高血壓血管重構(gòu)和高血壓內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的作用,本實驗用免疫組化染色觀察PERK在不同周齡自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)大鼠主動脈中的表達(dá),從而進(jìn)一步明確高血壓發(fā)生發(fā)展的可能機制。
　　研究方法
　　第一部分:選擇生長狀態(tài)良好的5~8代體外培養(yǎng)HUVECs進(jìn)行實驗。相差顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況,待細(xì)胞活力旺盛即細(xì)胞處于對數(shù)期生長時,無血清培養(yǎng)6h,分組如下:①Ang

3、Ⅱ1組(10-5mol/LAngⅡ+無血清培養(yǎng)基,培養(yǎng)24h)②AngⅡ2組(10-6mol/LAngⅡ+無血清培養(yǎng)基,培養(yǎng)24h)③AngⅡ3組(10-8mol/LAngⅡ+無血清培養(yǎng)基,培養(yǎng)24h)④ERStress阻斷劑組(ERStress阻斷劑salubrinal+無血清培養(yǎng)基1h后,加入AngⅡ使終濃度至10-6mol/L,培養(yǎng)24h)⑤空白對照組(無血清培養(yǎng)基,培養(yǎng)24h)。收集細(xì)胞,MTT法檢測細(xì)胞凋亡率,透射電鏡觀察內(nèi)質(zhì)

4、網(wǎng)的形態(tài)學(xué)改變,細(xì)胞免疫熒光化學(xué)和western-blotting法檢測ERStress標(biāo)記蛋白PERK、IRE1α、BiP、Ero1-Lα及PDI在內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá),并觀察PERK通路阻斷劑salubrinal對HUVECs是否有保護(hù)作用。第二部分:飼養(yǎng)雄性自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)和WistarKyoto(WKY)大鼠各15只,每周測大鼠尾動脈壓一次,分別在8、16、24周齡處死動物,取出胸主動脈,HE染色觀察不同周齡高血壓大鼠血管

5、內(nèi)皮細(xì)胞變化,免疫組化染色觀察ERstress重要成員PERK在大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)。
　　研究結(jié)果第一部分:經(jīng)MTT法檢測,與對照組相比較,AngⅡ處理后HUVECs的凋亡率明顯增加,隨著AngⅡ濃度的增高(10-9mol/L~10-4mol/L),HUVECs的凋亡率明顯增加(P<0.05)。透射電鏡下觀察,10-8mol/LAngⅡ處理的HUVECs出現(xiàn)細(xì)胞核膜不清晰,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)高度擴張、顆粒不完整;10-5mol/L

6、AngⅡ處理的HUVECs大量細(xì)胞胞核消失,核仁崩解碎裂,細(xì)胞器稀少,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)消失。免疫熒光化學(xué)和western-blotting檢測結(jié)果表明,HUVECs正常情況下僅表達(dá)少量的PERK、IRE1α、BiP和Ero1-Lα,AngⅡ處理顯著上調(diào)PERK、IRE1α、BiP和Ero1-Lα蛋白的表達(dá)(P<0.05),且隨著AngⅡ濃度增加,培養(yǎng)的HUVECs中ERstress標(biāo)志蛋白表達(dá)量逐漸增加(P<0.05),呈現(xiàn)濃度依賴性;經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分

7、析,PERK、IRE1α、BiP和Ero1-Lα兩兩之間成正相關(guān)(P<0.05);各組細(xì)胞中PDI蛋白的表達(dá)沒有明顯差異(P>0.05)。觀察發(fā)現(xiàn),PERK通路阻斷劑salubrinal對AngⅡ誘導(dǎo)的HUVECs凋亡沒有明顯的保護(hù)作用,且salubrinal本身對HUVECs有一定的毒性。
　　第二部分:隨著周齡的增加,SHR大鼠的動脈血壓持續(xù)增高;8周齡開始,SHR大鼠的主動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞粗糙不平,并出現(xiàn)部分脫落,16周齡和2

8、4周齡后,出現(xiàn)的內(nèi)皮細(xì)胞脫落逐漸增多;免疫組化檢測,PERK在SHR組大鼠中的表達(dá)均高于同周齡的WKY組大鼠,且隨著周齡的增加,PERK在SHR組大鼠中的表達(dá)也持續(xù)增加。
　　結(jié)論
　　1.高血壓狀態(tài)可以導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷,凋亡率增加;
　　2.PERK、IRE1α、BiP和Ero1-Lα蛋白等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路蛋白可能參與了高血壓誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷;
　　3.PERK、IRE1α、BiP和Ero1-Lα具有協(xié)