一氧化碳和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白CHOP在環(huán)孢霉素A引起的腎小球內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的作用.pdf

1、腎移植是腎臟失能的首選治療方法，但移植排異反應(yīng)將導(dǎo)致移植腎失能，因此需終生使用免疫抑制劑。環(huán)孢霉素A（CyclosporineA,CsA）是重要的抗移植排異反應(yīng)藥物，但CsA對(duì)腎臟具有毒性作用，是移植腎慢性失能的重要原因。腎小球內(nèi)皮細(xì)胞(Glomerularendothelialcells,GECs)損傷是移植腎慢性失能的重要機(jī)制，但藥理劑量的CsA是否可導(dǎo)致腎小球內(nèi)皮細(xì)胞損傷尚不清楚。血紅素加氧酶-1(hemeoxygenase-1，

2、HO-1)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成并在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)起作用的應(yīng)激蛋白，通過其代謝產(chǎn)物CO等起抗炎、抗氧化、抗凋亡的作用，可抑制宿主對(duì)移植物的排異反應(yīng)。但HO-1及其作用產(chǎn)物一氧化碳（CO）是否對(duì)腎血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷有保護(hù)作用尚未見研究。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（EndoplasmicreticulumstressERs）是亞細(xì)胞水平的細(xì)胞內(nèi)保護(hù)機(jī)制，適度的ERs促進(jìn)細(xì)胞修復(fù)，重度的ERs誘導(dǎo)無法修復(fù)的細(xì)胞凋亡，但腎小球血管內(nèi)皮細(xì)胞是否存在ERs以及ERs在腎小球血管內(nèi)皮細(xì)

3、胞生理與病理生理功能中的作用尚未見報(bào)道。
　　目的:利用原代培養(yǎng)的腎小球內(nèi)皮細(xì)胞，觀察藥理劑量的CsA對(duì)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)特性和ERs的影響；通過誘導(dǎo)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞HO-1表達(dá)，或給予HO-1產(chǎn)物CO，以探討HO-1與CsA引起的腎小球內(nèi)皮細(xì)胞損傷和ERs的關(guān)系；利用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白CHOP的siRNA抑制CHOP表達(dá)，探討ERs在CsA引起的腎小球內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的作用。
　　方法:貼壁選擇法培養(yǎng)原代大鼠腎小球內(nèi)皮細(xì)胞，Cs

4、A刺激復(fù)制腎小球內(nèi)皮細(xì)胞損傷和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型，用化學(xué)誘導(dǎo)劑氯化高鐵血紅素（hemin）促進(jìn)HO-1表達(dá)，外源性一氧化碳分子釋放劑CORM-2處理細(xì)胞模擬HO-1的作用，用針對(duì)CHOP的siRNA抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激作用，用Westernblot和RT-PCR檢測(cè)HO-1、ATF-6和CHOP表達(dá)，用annexinV和PI雙染色法、MTT降解法和細(xì)胞單層劃痕法分別檢測(cè)細(xì)胞凋亡、增殖和遷移功能。
　　結(jié)果:
　　1．成功原代培養(yǎng)大鼠腎

5、小球血管內(nèi)皮細(xì)胞
　　所培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)Ⅷ因子相關(guān)抗原，細(xì)胞單層呈現(xiàn)典型的鵝卵石樣形態(tài)，不傳代培養(yǎng)1-2周后可形成管腔樣結(jié)構(gòu)。
　　2．CsA可損傷腎小球內(nèi)皮細(xì)胞和誘導(dǎo)ERs蛋白表達(dá)
　　原代培養(yǎng)的腎小球內(nèi)皮細(xì)胞給予CsA（25μmol/L）刺激后細(xì)胞增殖和遷移功能明顯降低，細(xì)胞凋亡顯著增加。CsA刺激8小時(shí)后，HO-1和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白CHOP的表達(dá)增加(P<0.01)，對(duì)照組未給予CsA刺激，無CHOP的表達(dá)。Cs

6、A對(duì)活性和非活性狀態(tài)的CHOP上游ER蛋白ATF-6含量均無顯著影響。
　　3.氯化高鐵血紅素對(duì)CsA誘發(fā)的腎小球內(nèi)皮細(xì)胞損傷無保護(hù)作用
　　HO-1的化學(xué)誘導(dǎo)劑氯化高鐵血紅素hemin（20μmol/L）刺激8小時(shí)，腎小球內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)HO-1蛋白和mRNA顯著增加，但其對(duì)HO-1表達(dá)的促進(jìn)作用不如藥理劑量（25μmol/L）的CsA明顯。Hemin對(duì)細(xì)胞增殖、遷移、凋亡和ATF-6表達(dá)與活化均無顯著影響，但可抑制CsA誘導(dǎo)

7、的CHOP蛋白表達(dá)量(P<0.05)。
　　4.一氧化碳可拮抗CsA對(duì)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的損傷作用
　　與未經(jīng)任何處理的對(duì)照組相比，外源性CO釋放劑CORM-2（30μmol/L，8小時(shí)）除了可抑制腎小球內(nèi)皮細(xì)胞遷移功能外，對(duì)其它指標(biāo)均無顯著影響。但CORM-2可阻斷CsA引起的細(xì)胞增殖抑制和凋亡，降低CHOP表達(dá)，對(duì)細(xì)胞遷移和ATF-6表達(dá)與活化無顯著影響。
　　5．CHOP可抑制CsA誘導(dǎo)的腎小球內(nèi)皮細(xì)胞凋亡
　

8、　正常腎小球內(nèi)皮細(xì)胞不表達(dá)CHOP，CsA刺激后CHOP表達(dá)和細(xì)胞凋亡顯著增加，成功用針對(duì)CHOP的siRNA抑制CsA誘導(dǎo)的CHOP表達(dá)后，細(xì)胞凋亡率降至正常水平，但CHOP-siRNA對(duì)CsA的其它生物學(xué)作用無顯著影響。
　　結(jié)論:本研究發(fā)現(xiàn)藥理劑量的CsA可直接抑制腎小球血管內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)功能并誘導(dǎo)其凋亡，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白CHOP表達(dá)增加是CsA誘導(dǎo)該細(xì)胞凋亡的主要機(jī)制。HO-1誘導(dǎo)劑hemin對(duì)CsA引起的腎小球血管內(nèi)皮細(xì)胞