內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在高尿酸誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的作用及機制研究.pdf

1、本文分為兩個部分進(jìn)行探討：
　　第一部分 不同濃度尿酸對體外原代培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞活性及功能的影響
　　目的：
　　1.體外原代培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，建立尿酸損傷的細(xì)胞模型。
　　2.驗證不同濃度尿酸對體外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞活性的影響，篩選出能夠?qū)е聝?nèi)皮細(xì)胞損傷的尿酸濃度。
　　方法：
　　1.細(xì)胞培養(yǎng)
　　原代培養(yǎng)的HUVECs購自德國PromoCell公司，采用內(nèi)皮細(xì)胞生長培養(yǎng)基(EGM)進(jìn)

2、行傳代培養(yǎng)，每日相差倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生長情況，選取生長良好的的3-5代細(xì)胞用于實驗。
　　2.細(xì)胞鑒定
　　將HUVEC傳代至激光共聚焦專用培養(yǎng)皿，24h后免疫熒光染色及流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)記物Von Willebrand factor(vWF)、CD31及Smooth muscle alpha-actin(α-SMA)的表達(dá)，對原代培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行鑒定。
　　3.細(xì)胞增殖檢測
　　將HUVEC傳代至9

3、6孔板，24h后更換含有不同濃度尿酸的培養(yǎng)液(0mg/dl、4mg/ml、6mg/ml、9mg/ml、12mg/ml)，誘導(dǎo)12h、24h及48h時，MTT法檢測細(xì)胞增殖情況。
　　4.細(xì)胞凋亡檢測
　　將HUVEC傳代至6孔板，24h后更換含有不同濃度尿酸的培養(yǎng)液(4mg/ml、6mg/ml、9mg/ml、12mg/ml)，分別在尿酸誘導(dǎo)前及誘導(dǎo)后12h、24h及48h收集細(xì)胞，利用Annexin V-FITC凋亡檢測試劑

4、盒對細(xì)胞進(jìn)行染色，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。
　　5.NO含量檢測
　　將HUVEC傳代至6孔板，24h后更換含有不同濃度尿酸的培養(yǎng)液(4mg/ml、6mg/ml、9mg/ml、12mg/m1)，分別在尿酸誘導(dǎo)前及誘導(dǎo)后12h、24h及48h收集細(xì)胞培養(yǎng)的上清液，硝酸還原酶法測定細(xì)胞培養(yǎng)液上清中NO的含量。
　　6.統(tǒng)計學(xué)分析
　　本文實驗數(shù)據(jù)均以mean±SD表示。采用SPSS19.0軟件行One-wayANO

5、VA分析，組間兩兩比較采用SNK-q test分析，以P＜0.05作為差異有顯著意義，P＜0.01作為差異有高度顯著性意義。
　　結(jié)果：
　　1.人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的體外原代培養(yǎng)及鑒定
　　體外原代培養(yǎng)的HUVEC形態(tài)不規(guī)則、扁平、呈橢圓形、梭形或多角形，細(xì)胞單層融合時呈典型“鋪路石”樣外觀，體外傳代至第6代時，細(xì)胞形態(tài)及生長規(guī)律未見明顯變化。免疫熒光染色及流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果均顯示原代培養(yǎng)的HUVECs中內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物v

6、WF及CD31表達(dá)陽性，成纖維細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA表達(dá)陰性，符合內(nèi)皮細(xì)胞特征。
　　2.不同濃度尿酸對細(xì)胞增殖的影響
　　MTT結(jié)果顯示，與對照組比較，4mg/dl及6mg/dl尿酸刺激后12h、24h及48h細(xì)胞增殖均未見明顯變化，9mg/dl尿酸刺激48h出現(xiàn)細(xì)胞增殖能力下降，12mg/dl尿酸刺激24h開始出現(xiàn)細(xì)胞增殖能力下降。
　　3.不同濃度尿酸對細(xì)胞凋亡的影響
　　凋亡檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，4m

7、g/dl尿酸刺激12h、24h及48h細(xì)胞凋亡均未見明顯變化，6mg/dl尿酸刺激48h細(xì)胞凋亡增加，9mg/dl尿酸刺激24h開始出現(xiàn)細(xì)胞凋亡增加，12mg/dl尿酸刺激12h即出現(xiàn)細(xì)胞凋亡增加，且呈時間依賴性增加。
　　4.不同濃度尿酸對細(xì)胞NO生成能力的影響
　　NO檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，4mg/dl尿酸刺激后各個時間點細(xì)胞上清液中NO含量均未見明顯變化，6mg/dl尿酸刺激48h細(xì)胞上清液中NO含量減少，9mg

8、/dl及12mg/dl尿酸刺激后12h均開始出現(xiàn)細(xì)胞上清液中NO含量減少，且呈時間依賴性減少。
　　結(jié)論：
　　1.在體外培養(yǎng)的原代HUVEC中，4mg/dl尿酸對細(xì)胞凋亡及增殖無明顯影響。
　　2.濃度高于6mg/dl時尿酸可呈濃度及時間依賴性的誘導(dǎo)凋亡并抑制HUVEC增殖。
　　3.濃度高于6mg/dl時尿酸呈濃度及時間依賴性的誘導(dǎo)HUVEC NO生成減少，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙。
　　第二部分 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)

9、激在高濃度尿酸誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙中作用的研究
　　目的：
　　1.觀察高濃度尿酸誘導(dǎo)后細(xì)胞內(nèi)ROS含量、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物的表達(dá)，探討氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在尿酸誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的作用。
　　2.檢測高濃度尿酸誘導(dǎo)后NO生成相關(guān)因子及信號通路的表達(dá)變化，并探討高尿酸導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙的機制。
　　方法：
　　1.尿酸誘導(dǎo)及藥物預(yù)處理
　　體外原代培養(yǎng)的HUVECs接種培養(yǎng)板后24h，更換含有

10、尿酸的EGM，分別置入37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)不同時間。進(jìn)行藥理學(xué)干預(yù)時，在尿酸誘導(dǎo)前分別給予氧清除劑PEG-SOD(100U/ml)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激緩解劑4PBA(10 mM)及PKC抑制劑polymyxin B(20μg/ml)預(yù)處理30min，在尿酸誘導(dǎo)后不同時間分別收集細(xì)胞。
　　2.細(xì)胞內(nèi)ROS含量的檢測
　　體外原代培養(yǎng)的HUVECs接種培養(yǎng)板后24h，更換含有12mg/dl尿酸的EGM，分別置入37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)

11、繼續(xù)培養(yǎng)3h、6h、12h、24h，利用特異性CM-H2DCFDA探針檢測細(xì)胞內(nèi)ROS含量。
　　3.Western blotting檢測
　　HUVECs接種培養(yǎng)板后24h，更換含有12mg/dl尿酸的EGM，分別在培養(yǎng)3h、6h、12h、24h時收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，western blotting檢測CHOP、ATF-6、Caspase-12、eNOS、PKC蛋白表達(dá)，及eNOS、PKC的磷酸化水平。
　　4

12、.免疫沉淀法檢測eNOS/CaM的相互作用
　　HUVECs接種培養(yǎng)板后24h，更換含有12mg/dl尿酸的EGM，分別在培養(yǎng)3h、6h、12h、24h時收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，利用eNOS抗體與抗原結(jié)合，并與protein A瓊脂糖珠耦聯(lián)后沉淀的原理，使eNOS及與之結(jié)合的蛋白共同沉淀，聯(lián)合western blotting可以柃測出與eNOS結(jié)合的CaM蛋白含量，間接反應(yīng)eNOS/CaM的相互作用。
　　5.胞漿鈣離子濃

13、度檢測HUVECs接種培養(yǎng)板，尿酸誘導(dǎo)3h、6h、12h、24h時，采用鈣離子特異性熒光探針Fluo-3 AM染色，熒光顯微鏡下觀察胞漿內(nèi)鈣離子濃度變化。
　　6.eNOS活性及NO生成的檢測
　　尿酸誘導(dǎo)前分別給予活性氧清除劑PEG-SOD，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激緩解劑4PBA，PKC抑制劑polymyxin B預(yù)處理，尿酸誘導(dǎo)48h收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)的上清液，對細(xì)胞內(nèi)eNOS活性及細(xì)胞上清液中NO含量進(jìn)行檢測。
　　結(jié)果：

14、r>　　1.高濃度尿酸對細(xì)胞內(nèi)ROS生成的影響
　　與對照組比較，高濃度尿酸(12mg/dl)刺激后3h開始檢測到細(xì)胞內(nèi)ROS生成增多，在12h達(dá)到高峰，24h時持續(xù)高表達(dá)。100U/ml PEG-SOD預(yù)處理能有效抑制尿酸導(dǎo)致的ROS生成增加。
　　2.高濃度尿酸對細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響
　　結(jié)果顯示，與對照組比較，尿酸誘導(dǎo)后6h開始檢測到細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物ATF-6、CHOP表達(dá)增加，在12h達(dá)到高峰;12h開始檢

15、測到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑凋亡因子caspase-12表達(dá)增加，24h達(dá)到高峰。PEG-SOD(100U/ml)及4PBA(10 mM)均能有效抑制UA誘導(dǎo)的ATF6、CHOP及caspase12表達(dá)增加。
　　3.氧清除劑及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑拮抗尿酸導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡及NO生成減少
　　結(jié)果顯示，與對照組比較，UA(12mg/dl)刺激48h后，細(xì)胞凋亡明40顯增加、NO生成明顯減少;抗氧化劑PEG-SOD(100U/ml)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制

16、劑4PBA(10 mM)均可有效抑制UA導(dǎo)致的凋亡增加及NO生成減少
　　4.尿酸通過增加Thr495位點的磷酸化降低eNOS活性
　　尿酸刺激后各個時間點，細(xì)胞內(nèi)CaM蛋白表達(dá)量、胞漿鈣離子濃度、eNOS總蛋白表達(dá)量均未見明顯改變。進(jìn)一步對eNOS的磷酸化水平進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示尿酸刺激后eNOS-Ser1177位點的磷酸化水平無明顯變化，eNOS-Thr495位點的磷酸化水平明顯增加。免疫沉淀結(jié)果顯示，尿酸刺激后與eNOS

17、結(jié)合的CaM明顯減少，提示eNOS/CaM的相互作用減弱。
　　5.尿酸通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激/PKC信號通路降低eNOS活性
　　結(jié)果顯示:PKC總蛋白含量在尿酸刺激后6h，12h及24h均無明顯變化，p-PKC蛋白含量在尿酸刺激6h開始增加，12h達(dá)到高峰;PEG-SOD、4PBA預(yù)處理可有效抑制UA誘導(dǎo)的PKC磷酸化增加。PEG-SOD、4PBApolymyxin B均能夠抑制UA誘導(dǎo)的eNOS Thr495位點的磷酸化水平增

18、加及eNOS活性下降。
　　結(jié)論：
　　1.高尿酸可誘導(dǎo)HUVEC發(fā)生氧化應(yīng)激，并啟動內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生，誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑的細(xì)胞凋亡。
　　2.高尿酸誘導(dǎo)后HUVEC內(nèi)eNOS在Thr495位點磷酸化增加，降低eNOS與CaM的相互作用，導(dǎo)致eNOS活性下降，NO釋放減少。
　　3.高尿酸誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過激活PKC信號通路調(diào)控eNOS活性。
　　4.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑能夠有效拮抗高尿酸誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙。