褪黑素對H2O2誘導(dǎo)的大鼠腦微血管周細(xì)胞損傷的影響.pdf

1、目的：
　　 第一部分：探討獲取高純度大鼠原代腦微血管周細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法，并對其鑒定。
　　 第二部分：探討褪黑素在過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的大鼠腦微血管周細(xì)胞損傷中的保護(hù)作用。
　　 第三部分：探討褪黑素抑制H2O2誘導(dǎo)的大鼠腦微血管周細(xì)胞凋亡的保護(hù)機(jī)制。
　　 方法：
　　 第一部分：選取10只3周齡Wistar大鼠，取大腦，去除白質(zhì)，剪碎成大約1mm3大小，通過兩次酶消化、20％BSA離

2、心和33%連續(xù)密度Percoll梯度離心獲得純度較高的大腦微血管片段，接種于35mm培養(yǎng)皿中，加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基,37℃、5%CO2細(xì)胞孵箱中培養(yǎng)，2天后更換新鮮培養(yǎng)基；采用倒置顯微鏡觀察周細(xì)胞生長狀況及其形態(tài)；免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測NG2、α-SMA、vWF及GFAP表達(dá)，鑒定分離的細(xì)胞及其純度；MTT法檢測繪制其增殖曲線。
　　 第二部分：應(yīng)用MTT試驗和臺盼藍(lán)拒染試驗檢測不同濃度H2O2處理后腦微血管周細(xì)胞的細(xì)

3、胞活力；應(yīng)用胞內(nèi)反應(yīng)性氧簇檢測試劑盒檢測褪黑素及抗氧化劑GSH對胞內(nèi)活性氧聚集的影響；采用TUNEL法確定細(xì)胞死亡類型；檢測褪黑素及GSH對H2O2誘導(dǎo)大鼠腦微血管周細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。
　　 第三部分：檢測褪黑素及抗氧化劑GSH對H2O2誘導(dǎo)的腦微血管周細(xì)胞凋亡過程中關(guān)鍵蛋白Caspase-3的活性影響；應(yīng)用Westernblot法檢測凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2的表達(dá)，觀察褪黑素在H2O2誘導(dǎo)腦微血管周細(xì)胞凋亡中的作用。<

4、br>　　 結(jié)果：第一部分：培養(yǎng)5天左右可見周細(xì)胞從貼壁的腦微血管片段周圍長出；培養(yǎng)的周細(xì)胞成不規(guī)則外形，在某些區(qū)域可重疊生長；8～10天可形成匯合；腦周細(xì)胞擁有長的細(xì)胞突觸、較大的細(xì)胞體及圓形的細(xì)胞核；免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示腦微血管周細(xì)胞NG2和α-SMA表達(dá)陽性，并可同時表達(dá)這兩種標(biāo)志物，而對vWF和GFAP兩種蛋白的免疫反應(yīng)呈陰性，排除了內(nèi)皮細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的存在；培養(yǎng)的周細(xì)胞純度達(dá)96%以上；在培養(yǎng)到第10天左右增殖至頂峰

5、。
　　 第二部分：MTT結(jié)果顯示，H2O2處理腦微血管周細(xì)胞可引起劑量依賴的細(xì)胞毒性作用；使用0.05mM、0.1mM和0.2mMH2O2作用腦微血管周細(xì)胞2h可分別導(dǎo)致大約12%、25%和28%的細(xì)胞死亡(P＜0.05)，當(dāng)使用0.5mMH2O2處理時可誘導(dǎo)大約38%的細(xì)胞死亡(P＜0.01)；而當(dāng)使用1mMH2O2處理時會誘導(dǎo)大部分(78%)周細(xì)胞死亡；應(yīng)用臺盼藍(lán)拒染試驗也得到了一致的結(jié)果；胞內(nèi)活性氧檢測結(jié)果顯示使用褪黑素

6、或抗氧化劑GSH預(yù)孵育可分別降低胞內(nèi)活性氧大約27%或36%。；TUNEL實驗結(jié)果表明，H2O2誘導(dǎo)的腦周細(xì)胞死亡是由凋亡介導(dǎo)的；與H2O2處理組相比，褪黑素(0.1mM)預(yù)處理可減少一半數(shù)量的H2O2誘導(dǎo)的TUNEL-陽性細(xì)胞；抗氧化劑GSH(0.5mM)也可降低H2O2誘導(dǎo)的周細(xì)胞凋亡。
　　 第三部分：H2O2(0.5mM)處理腦周細(xì)胞可顯著增加Caspase-3活性，與對照相比增加約2.24倍(P＜0.05)，應(yīng)用褪黑素

7、(0.1mM)或GSH(0.5mM)預(yù)9呼育后可減弱H2O2引起的Caspase-3活性的增加，與H2O2-處理組相比降低約19%(P＜0.01)；Westernblot結(jié)果顯示，與對照組相比，H2O2(0.5mM)處理周細(xì)胞(2h)可顯著降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，下降約50%(P＜0.05)；與H2O2處理組相比，使用褪黑素(0.1mM)預(yù)處理可上調(diào)Bcl-2的表達(dá)，大約增加3倍(P＜0.01)；但是，對促凋亡蛋白Bax的影響很