DHEA對H2O2誘導(dǎo)的原代大鼠睪丸間質(zhì)細胞氧化損傷的保護及修復(fù)作用研究.pdf

1、脫氫表雄酮（Dehydroepiandrosterone，DHEA）作為機體內(nèi)重要的一種甾體類化合物，是體內(nèi)各種類固醇激素合成的重要前體。DHEA與其他類固醇激素最大的不同之處在于其血漿中的濃度會隨著年齡的增長下降明顯，故推測DHEA的減少與機體衰老密切相關(guān)。H2O2作為活性氧在體內(nèi)的主要存在形式，其極易透過細胞膜對細胞造成損傷。睪丸間質(zhì)細胞是合成和分泌雄激素的主要場所，而睪酮作為雄性動物體內(nèi)最重要的雄激素，其含量的95％是由睪丸間質(zhì)細

2、胞分泌的。已有研究表明，外源性DHEA對H2O2引起的細胞損傷具有一定保護和修復(fù)作用，但其具體機制還不是很清楚。因此，本試驗在建立一種可靠的H2O2誘導(dǎo)的原代大鼠睪丸間質(zhì)細胞氧化損傷模型基礎(chǔ)之上，探討外源性DHEA對H2O2誘導(dǎo)的原代大鼠睪丸間質(zhì)細胞抗氧化功能、核DNA損傷以及細胞凋亡相關(guān)因子的影響;在證實DHEA對H2O2誘導(dǎo)的原代大鼠睪丸間質(zhì)細胞抗氧化功能及核DNA損傷具有一定的保護和修復(fù)作用基礎(chǔ)之上，重點從基因和蛋白水平上檢測DH

3、EA對H2O2誘導(dǎo)的原代大鼠睪丸間質(zhì)細胞凋亡途徑中相關(guān)因子mRNA和蛋白表達水平的變化的影響，進而深入探討PI3K/Akt信號通路在細胞凋亡過程中的作用，研究旨在揭示DHEA在降低H2O2誘導(dǎo)的原代大鼠睪丸間質(zhì)細胞凋亡過程中的作用，從而為深入闡明DHEA的抗氧化損傷作用提供理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。
　　1、H2O2誘導(dǎo)原代大鼠睪丸間質(zhì)細胞氧化損傷模型的建立
　　為了建立體外模擬氧自由基誘導(dǎo)的細胞氧化損傷模型，本試驗采用Perco

4、ll密度梯度離心法純化原代大鼠睪丸間質(zhì)細胞，并鑒定特異性蛋白3β-HSD;采用MTT法檢測細胞活力，流式細胞術(shù)測定細胞凋亡率、線粒體膜電位、ROS以及O2-含量，比色法測定·OH、MDA的含量以及抗氧化物酶SOD、CAT、POD和GSH-Px的活性。結(jié)果顯示:特異性蛋白3β-HSD鑒定后，熒光顯微鏡觀察到大部分細胞呈現(xiàn)特異性熒光。MTT測定結(jié)果顯示，300～1000μmol/L H2O2處理Leydig細胞均可極顯著降低細胞活力(P＜0

5、.01);300μmol/L H2O2處理可顯著升高Leydig細胞的凋亡率（P＜0.05）以及增加ROS含量(P＜0.05)和·OH含量(P＜0.01），但可顯著降低線粒體膜電位(P＜0.05)。 H2O2處理對細胞內(nèi)SOD、CAT、POD和GSH-Px的活性無顯著影響(P＞0.05)，但可顯著升高細胞內(nèi)MDA的含量（P＜0.05）。結(jié)論:300μmol/LH2O2處理Leydig細胞8h可以誘導(dǎo)細胞氧化損傷，成功建立了體外模擬氧自由

6、基誘導(dǎo)細胞氧化損傷模型。
　　2、DHEA對H2O2誘導(dǎo)的原代大鼠睪丸間質(zhì)細胞氧化損傷的保護作用研究
　　本試驗以原代大鼠睪丸間質(zhì)細胞為研究對象，以300μmol/LH2O2為氧化損傷誘導(dǎo)劑，探討外源性DHEA對H2O2誘導(dǎo)的原代大鼠睪丸間質(zhì)細胞抗氧化功能和細胞凋亡相關(guān)因子的影響。用含DHEA終濃度分別為1μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L的培養(yǎng)液孵育原代大鼠睪丸間質(zhì)細胞24h以含0.1％D

7、MSO作為對照組;;之后各處理組用終濃度為300μmol/L的H2O2培養(yǎng)液誘導(dǎo)原代大鼠睪丸間質(zhì)細胞8h，收集細胞，待測。采用MTT法檢測細胞活力、放射免疫分析法檢測睪酮含量，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率、線粒體膜電位、ROS和O2-含量，比色法測定·OH、MDA的含量以及抗氧化物酶SOD、CAT、POD和GSH-Px的活性，單細胞凝膠電泳技術(shù)檢測核DNA損傷，Real-time PCR法檢測OGG1、Bcl-2、Bax、caspase-9

8、、caspase-3、caspase-7mRNA表達水平的變化。結(jié)果顯示，與損傷對照組相比，DHEA處理可顯著提高細胞活力(P＜0.05），并同時可恢復(fù)原代大鼠睪丸間質(zhì)細胞分泌睪酮的生物學(xué)功能(P＜0.01); DHEA處理可顯著降低細胞ROS含量(P＜0.05)、MDA含量(P＜0.05)和·OH含量(P＜0.01）; DHEA處理可顯著提高細胞POD活性(P＜0.05），但顯著降低細胞GSH-Px活性(P＜0.05）;不同濃度的DH

9、EA處理對細胞O2-含量、SOD及CAT活性并無顯著影響(P＜0.05）。結(jié)果提示，DHEA對H2O2誘導(dǎo)的原代大鼠睪丸間質(zhì)細胞活力下降和分泌睪酮功減弱起到一定保護作用;對H2O2誘導(dǎo)的原代大鼠睪丸間質(zhì)細胞抗氧化功能減弱的保護作用是通過增強POD活性，減少·OH及由其攻擊細胞膜產(chǎn)生的MDA含量，最終降低機體內(nèi)ROS的含量，并增強機體內(nèi)抗氧化酶的活性來實現(xiàn)的。
　　與損傷對照組相比，DHEA處理可顯著降低細胞凋亡率（P＜0.05）和

10、極顯著降低細胞核DNA Olive尾矩（P＜0.01）;DHEA處理可顯著提高OGG1 mRNA表達水平(P＜0.05)，同時可顯著降低Bax、caspase-9、caspase-3、caspase-7 mRNA表達水平(P＜0.05)。結(jié)果提示，DHEA對H2O2誘導(dǎo)原代大鼠睪丸間質(zhì)細胞核DNA損傷具有一定保護作用，主要是通過增強OGG1 mRNA水平表達來實現(xiàn);DHEA對H2O2誘導(dǎo)的原代大鼠睪丸間質(zhì)細胞凋亡的保護作用主要是降低凋亡

11、基因Bax、caspase-9、caspase-3、caspase-7 mRNA表達水平以及Bax/Bcl-2比值，最終減少細胞凋亡。
　　3、DHEA對H2O2誘導(dǎo)的原代大鼠睪丸間質(zhì)細胞氧化損傷的修復(fù)作用及其機制研究
　　本試驗以原代大鼠睪丸間質(zhì)細胞為研究對象，以300μmol/L H2O2為氧化損傷誘導(dǎo)劑，探討外源性DHEA對H2O2誘導(dǎo)的原代大鼠睪丸間質(zhì)細胞抗氧化功能、細胞凋亡的影響及其細胞生物學(xué)機制的研究。用含H2O

12、2終濃度為300μmol/L的培養(yǎng)液誘導(dǎo)原代大鼠睪丸間質(zhì)細胞8h，造成睪丸間質(zhì)細胞氧化損傷后，再用含DHEA終濃度分別為1μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L的培養(yǎng)液孵育原代大鼠睪丸間質(zhì)細胞24h，以含0.1％DMSO作為對照組，收集細胞，待測。采用MTT法檢測細胞活力、放射免疫分析法檢測睪酮含量，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率、線粒體膜電位、ROS和O2-含量，比色法測定·OH、MDA的含量以及抗氧化物酶活性

13、，單細胞凝膠電泳技術(shù)檢測核DNA損傷，Real-time PCR法檢測DNA損傷的修復(fù)基因以及細胞凋亡基因mRNA表達水平的變化，western blot檢測細胞凋亡途徑中關(guān)鍵因子的表達變化。結(jié)果表明，與損傷對照組相比，DHEA處理可極顯著提高細胞活力(P＜0.01)，并可恢復(fù)原代睪丸間質(zhì)細胞分泌睪酮的生物學(xué)功能(P＜0.01); DHEA處理可極顯著降低細胞ROS和·OH的含量(P＜0.01); DHEA處理可顯著提高睪丸間質(zhì)細胞內(nèi)S

14、OD、CAT和POD活性（P＜0.05），同時DHEA處理可顯著降低細胞MDA含量(P＜0.05）。結(jié)果提示，DHEA對H2O2誘導(dǎo)的原代大鼠睪丸間質(zhì)細胞活力下降和睪酮分泌功能的降低起到一定修復(fù)作用;對H2O2誘導(dǎo)的原代大鼠睪丸間質(zhì)細胞抗氧化功能減弱的修復(fù)作用是通過增強SOD、CAT及POD活性，減少·OH及由其攻擊細胞膜產(chǎn)生的MDA含量，最終降低細胞內(nèi)ROS含量并增強機體內(nèi)抗氧化酶活性實現(xiàn)的。
　　與損傷對照組相比，DHEA處理

15、可顯著降低細胞凋亡率(P＜0.05)和極顯著降低細胞核DNA Olive尾矩(P＜0.01); DHEA處理可顯著提高細胞線粒體膜電位(P＜0.05）;不同濃度的DHEA處理可顯著提高細胞OGG1、PI3K、Akt和Bcl-2 mRNA表達水平(P＜0.05），同時可顯著降低細胞Bax、caspase-9、caspase-3和caspase-7 mRNA表達水平(P＜0.05)。 Western blot分析結(jié)果表明，DHEA處理可顯著

16、提高睪丸間質(zhì)細胞PI3K和p-Akt蛋白表達水平(P＜0.05），且可顯著降低細胞Bax和caspase-3蛋白表達水平（P＜0.05）;在加入PI3K抑制劑(LY294002)處理后，DHEA處理可顯著降低細胞PI3K(P＜0.05），但對p-Akt、Bax和caspase-3蛋白表達水平并未發(fā)現(xiàn)顯著影響。結(jié)果提示，DHEA對H2O2誘導(dǎo)原代大鼠睪丸間質(zhì)細胞DNA損傷的修復(fù)作用是通過增強OGG1mRNA水平表達來實現(xiàn);DHEA對H2O