天麻酚性成分對H2O2誘導PC12細胞氧化損傷的保護作用研究.pdf

1、目的：課題組前期研究證明天麻具有較強的抗腦缺血再灌注損傷作用，并提示其作用機制與抗氧化損傷有關，其活性為一組脂溶性酚性成分。本研究以H2O2誘導損傷PC12細胞為細胞氧化應激損傷模型，對天麻3個提取物和15份單體成分進行活性篩選，探討天麻酚性成分對細胞氧化應激損傷的保護作用，并初步探討其可能的作用機制。
　　 方法：⑴采用RPMI-1640培養(yǎng)基、含10％FBS和0.4％雙抗的常規(guī)培養(yǎng)條件對PC12細胞進行培養(yǎng)、傳代和凍存，并以

2、MTT法、細胞計數法和臺盼藍染色計數法繪制其生長曲線，初步掌握PC12細胞的體外生長增殖特性。⑵采用細胞形態(tài)學觀察和MTT法測定細胞存活率作為評價指標，探討研究用H2O2誘導PC12細胞氧化損傷模型的適宜濃度。⑶采用細胞形態(tài)學觀察和MTT法測定細胞存活率作為評價指標，探討研究用依達拉奉對H2O2誘導的PC12細胞氧化損傷模型的有效濃度。⑷采用細胞形態(tài)學觀察和MTT法測定細胞存活率作為評價指標，評價天麻3個提取物和15份單體成分對H2O2

3、誘導的PC12細胞氧化損傷模型的保護作用。⑸采用DCFH-DA熒光探針法、LDH酶標法、硫代巴比妥酸酶標法和T-SOD羥胺法，評價天麻活性成分對H2O2誘導的PC12細胞內ROS水平、細胞外LDH活性、LDH泄漏率、細胞內MDA含量和SOD活性的影響。
　　 結果：①從MTT法繪制的生長曲線得出，在本實驗室96孔板常規(guī)培養(yǎng)的條件下，PC12細胞數量以100個/mL接種培養(yǎng)6d未達到平臺期，100000個/mL細胞接種3d即達到平

4、臺期，適宜的細胞接種濃度為6000、8000和10000個/mL細胞，確定選擇8000個/mL細胞的接種濃度在25 cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，繪制培養(yǎng)瓶培養(yǎng)PC12細胞生長曲線。從細胞計數法和臺盼藍染色計數法繪制的生長曲線得出，以8000個/mL的細胞濃度接種在25 cm2培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)到第4d長至約90％的覆蓋率，第5d時長滿，隨著細胞數量的不斷增多、生長空間減少，細胞發(fā)生接觸抑制和密度抑制。②40μmol·L-1-80μmol·L-1的H

5、2O2可使PC12細胞數量逐漸減少，多數細胞突起收回，胞體變圓，部分變圓細胞成團存在，胞體邊緣模糊，折光性減弱，貼壁能力降低;與正常組比較，40μmol·L-1-80μmol·L-1的H2O2誘導PC12細胞存活率在18.6％-66.0％的損傷（P＜0.01），氧化損傷PC12細胞的H2O2適宜濃度范圍在40μmol·L-1-80μmol·L-1。③依達拉奉在0.918 mmol·L-1(160μg·mL-1)給藥濃度下對50μmol·

6、L-1H2O2誘導PC12細胞損傷的形態(tài)改善最為明顯。細胞存活率檢測結果:與正常組比較，50μmol·L-1 H2O2損傷PC12細胞2h后的模型組細胞存活率為26.9％（P＜0.01）;與模型組比較，依達拉奉在給藥濃度達到0.918 mmol/L時提高細胞存活率10.9個百分點(P＜0.01)。④天麻3個提取物及15份單體中，天麻EtOAc(20μg·mL-1)和8#(80μg·mL-1)對50μmol·L-1 H2O2誘導PC12細

7、胞損傷的形態(tài)改善最為明顯。細胞存活率檢測結果:與模型組比較，天麻EtOAc(20μg·mL-1)和8#(80μg·mL-1)分別提高細胞存活率14.7和9.9個百分點（P＜0.01），1#和6#也提高細胞存活率（P＜0.05或P＜0.01），其同濃度結果重復性差。⑤天麻EtOAc和8#對H2O2誘導的PC12細胞內ROS水平、細胞外LDH活性、LDH泄漏率、細胞內MDA含量和SOD活性測試結果表明，與模型組比較，天麻EtOAc(80μg

8、·mL-1)和8#(40、80μg·mL-1)受試物組對細胞產生的熒光強度降低差異明顯(P＜0.01);天麻EtOAc(20、40、80μg·mL-1)受試物組胞外的LDH活性明顯低于模型組（P＜0.05或P＜0.01），LDH泄漏率降低差異明顯（P＜0.05或P＜0.01），8#(40、80μg·mL-1)受試物組胞外LDH活性明顯高于模型組（P＜0.05或P＜0.01），提高LDH泄漏率的差異明顯（P＜0.01）;天麻EtOAc(2

9、0、40、80μg·mL-1)受試物組降低細胞內MDA含量的趨勢明顯，其中40μg·mL-1組降低細胞內MDA含量的差異明顯（P＜0.05）;天麻EtOAc(20、40μg·mL-1)和8#(20、40μg·mL-1)受試物組提高細胞內的T-SOD活性差異明顯（P＜0.01），天麻EtOAc和8#的80μg·mL-1給藥組降低細胞內T-SOD活性差異明顯(P＜0.01)。
　　 結論：⑴在25 cm2培養(yǎng)瓶中以8000個/mL（

10、1600個/cm2）細胞懸液接種PC12細胞培養(yǎng)到第4d時的細胞最適宜細胞傳代、接種和凍存，其群體倍增時間介于12h至24h之間。⑵采用40μmol·L-1-80μmol·L-1的H2O2損傷PC12細胞2h可復制PC12細胞氧化應激損傷模型。⑶依達拉奉對H2O2損傷PC12細胞2h造成氧化應激損傷模型的較佳保護濃度為0.918 mmol·L-1(160μg·mL-1)。⑷天麻酚性成分8#、1#、6#和天麻EtOAc提取物具有改善氧化損