BZYX改善嚙齒類動(dòng)物記憶損傷并保護(hù)H-,2-O-,2-誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷.pdf

1、目的:BZYX是從一系列茚酮類衍生物中篩選得到的具有雙結(jié)合位點(diǎn)的新型膽堿酯酶抑制劑。本研究通過考察該化合物拮抗膽堿酯酶活性、增強(qiáng)記憶損傷模型動(dòng)物的認(rèn)知能力以及對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用，系統(tǒng)評(píng)價(jià)BZYX對(duì)Alzheimer病的療效，為其臨床試驗(yàn)提供藥效學(xué)依據(jù)。
　　 方法:應(yīng)用改良的Ellman's assay檢測(cè)BZYX與其他四種已上市的膽堿酯酶抑制劑的酶抑制活性。應(yīng)用腹腔注射氫溴酸東莨菪堿、皮下注射亞硝酸鈉和灌胃給予40％乙醇分別

2、造成嚙齒類動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶獲得障礙、記憶鞏固障礙和記憶再現(xiàn)障礙。小鼠被動(dòng)回避試驗(yàn)和大鼠八臂迷宮試驗(yàn)分別檢測(cè)BZYX增強(qiáng)嚙齒類動(dòng)物認(rèn)知能力的作用。BZYX的保護(hù)作用在大鼠髓質(zhì)嗜鉻瘤細(xì)胞PC12上進(jìn)行。MTT assay檢測(cè)不同濃度BZYX下400μM過氧化氫(H2O2)處理后PC12細(xì)胞的存活率，同時(shí)，采用Annexin V-FITC/Propidium iodide(PI)凋亡試劑盒和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同條件下PC12細(xì)胞凋亡情況。JC-1染

3、色和DCFH-DA染色分別檢測(cè)線粒體膜電位(△ψm)和ROS含量的變化。Western Blotting檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量的變化。
　　 結(jié)果:Ellman's實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，BZYX能有效地抑制乙酰膽堿酯酶的活性，IC50BZYX:0.058±0.022μM；多奈哌齊：0.019±0.004μM；利伐斯的明：3.81±2.81μM；加蘭他敏：3.01±1.85μM；哈伯因：0.053±0.016μM。同時(shí)，BZYX較其它上市

4、藥物對(duì)膽堿酯酶具有更好的選擇性，對(duì)乙酰膽堿酯酶的選擇性高于丁酰膽堿酯酶4426倍。小鼠被動(dòng)回避實(shí)驗(yàn)和大鼠八臂迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，BZYX對(duì)東莨菪堿、亞硝酸鈉、乙醇所致的動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶獲得、鞏固和再現(xiàn)障礙有很好的逆轉(zhuǎn)作用，效果與多奈哌齊和利伐斯的明相當(dāng)。BZYX能有效地對(duì)抗400μM H2O2所致的PC12細(xì)胞損傷。細(xì)胞形態(tài)學(xué)顯示，400μM H2O2處理后PC12細(xì)胞數(shù)量明顯減少，大部分細(xì)胞突觸消失并呈圓形，有些細(xì)胞破裂成細(xì)胞碎片。0.1和

5、1.0μMBZYX能明顯改善細(xì)胞的狀態(tài)。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，400μM H2O2能顯著地降低PC12細(xì)胞的存活率(40％)，0.1、0.5和1.0μM BZYX能有效地增加細(xì)胞存活率(83.2±3.7％，79.1±2.3％和89.6±3.4％)，并呈劑量依賴性。Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)和流式細(xì)胞術(shù)顯示出與MTT法相同的結(jié)果。JC-1染色結(jié)果顯示，0.1和1.0μM BZYX顯著地逆轉(zhuǎn)H2O2導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位的下降

6、。DCFH-DA染色結(jié)果表明，400μM H2O2處理PC12細(xì)胞1 h，能增加細(xì)胞平均綠色熒光強(qiáng)度2.4倍。0.1和1.0μM BZYX能顯著減少ROS的生成。Western Blotting結(jié)果顯示，BZYX預(yù)處理組能上調(diào)procaspase3和xIAP蛋白的表達(dá)，下調(diào)磷酸化JNK，p53的蛋白表達(dá)和caspase3的裂解。
　　 結(jié)論:以上結(jié)果驗(yàn)證了BZYX對(duì)東莨菪堿、亞硝酸鈉、乙醇所致的動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶獲得、鞏固和再現(xiàn)障礙有