黃芪苷Ⅳ通過ERK1-2信號(hào)通路抗H-,2-O-,2-誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞氧化損傷.pdf

1、目的:研究黃芪苷Ⅳ(astragalosideⅣ,AST)抗H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞氧化損傷的作用,探討該作用是否通過ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實(shí)現(xiàn)。
　　 方法:
　　 1.H2O2誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞損傷模型的建立用含10％FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)H9c2細(xì)胞24h,換用無FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基,用100,200,400μmol/L的H2O2處理細(xì)胞3,6,12h,采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率。選擇適宜的H2O2

2、濃度和作用時(shí)間,建立H2O2誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞損傷模型。
　　 2.AST抗H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞氧化損傷作用的研究用含10％FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)H9c2細(xì)胞24h,按以下分組分別加入不同藥物孵育6h。實(shí)驗(yàn)分4組:①正常對(duì)照組(Control組):加入無FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基；②模型組(H2O2組):加入200μmol/L的H2O2；③AST10+H2O2組:同時(shí)加入10mg/L的AST和200μmol/L的H2

3、O2；④AST20+H2O2組:同時(shí)加入20mg/L的AST和200μmol/L的H2O2。用MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率、比色法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase,LDH)活性、總超氧化物歧化酶(totalsuperoxidedismutase,T-SOD)和Mn超氧化物歧化酶(manganesesuperoxidedismutase,Mn-SOD)活力以及丙二醛(malondialdehyde,MDA)含

4、量。
　　 3.AST通過ERK1/2信號(hào)通路抗H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞氧化損傷作用的研究用含10％FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)H9c2細(xì)胞24h,按以下分組分別加入不同藥物孵育6h。實(shí)驗(yàn)分7組:①至④分組同上。⑤PD+H202組:加入50μmol/L的PD98059作用30min,再加入200μmol/L的HEO2；⑥PD+AST10+H2O2組:加入50μmol/L的PD98059作用30min,再同時(shí)加入10mg/L的

5、AST和200μmol/L的H2O2；⑦PD+AsT20+H2O2組:加入50μmol/L的PD98059作用30min,再同時(shí)加入20mg/L的AST和200μmol/L的H2O2。用MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率、比色法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性、T-SOD和Mn-SOD活力以及MDA含量；Westernblot檢測(cè)H9c2細(xì)胞ERK1/2蛋白的磷酸化水平。
　　 結(jié)果:
　　 1.H2O2誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞損傷模型的建立H2

6、O2處理3h,與Control組比較,100,200,400μmol/L的H2O2使細(xì)胞存活率隨濃度增加而顯著降低(94.6％±4.59％,84.7％±15.2％,66.3％±14.9％vs.100％±0,P<0.05)；H2O2處理6h,與Control組比較,100,200,400μmol/L的H2O2使細(xì)胞存活率隨濃度增加而顯著降低(92.5％±7.15％,63.9％±10.1％,30.8％±9.83％vs.100％±0,P<0.

7、01)；H2O2處理12h,與Control組比較,100,200,400μmol/L的H2O2使細(xì)胞存活率隨濃度增加而顯著降低(69.4％±10.9％,24.7％±3.06％,24.7％±2.61％vs.100％±0,P<0.01)。其中,在H2O2濃度為200μmol/L作用6h條件下,細(xì)胞存活率降低程度適中,實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性好,確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用200μmol/LH2O2作用6h建立模型。
　　 2.AST抗H2O2誘導(dǎo)的H9

8、e2細(xì)胞氧化損傷與Control組比較,200μmol/LH2O2作用6h使細(xì)胞存活率顯著降低(70.3％±6.52％vs.100％±0,P<0.01)；細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性顯著升高(289.4±15.8vs.26.7±6.6U/L,P<0.01)；T-SOD,Mn-SOD活力顯著降低(8.80±1.42vs.19.68±1.70,3.21±0.65vs.6.58±1.45U/ml,P<0.01)；MDA含量顯著升高(0.955±0.

9、120vs.0.307±0.056μmol/L,P<0.01)。
　　 與H2O2組比較,10mg/L及20mg/LAST均顯著提高細(xì)胞存活率(89.4％=7.57％,90.1％±4.04％vs.70.3％±6.52％,P<0.01)；使細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性顯著降低(147.2±34.3,170.4±14.0vs.289.4±15.8U/L,P<0.01)；T-SOD(14.99±0.98,13.76±2.06vs.8.80±

10、1.42U/ml,P<0.01)及Mn-SOD活力(6.434±0.69,6.15±0.97vs.3.21±0.65U/ml,P<0.01)顯著提高；MDA含量顯著降低(0.506±0.051,0.542±0.035Vs.0.955±0.120μmol/L,P<0.01)。
　　 3.AST通過ERK1/2信號(hào)通路抗H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞氧化損傷分別與10mg/L及20mg/LAST組比較,加入ERK1/2抑制劑PD9805

11、9后細(xì)胞存活率顯著降低(73.5％±5.96％vs.89.4％±7.57％,74.7％±74.7％vs.90.1％±4.04％,P<0.01)；細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性顯著提高(277.1±27.3vs.147.2±34.3,275.7±28.7vs.170.4±14.0U/L,P<0.01)；T-SOD(10.52±1.56vs.14.99±0.98,9.99±1.54vs.13.76±2.06U/ml,P<0.01)及Mn-SOD活力

12、(3.93±0.97vs.6.43±0.69,3.66±0.81vs.6.15±0.97U/ml,P<0.01)顯著降低；MDA含量顯著提高(0.844±0.054vs.0.506±0.051,0.855±0.043vs.0.542±0.035μmol/L,P<0.01)。
　　 10mg/L及20mg/LAST均顯著增加H2O2損傷的H9c2細(xì)胞P-ERK1/2蛋白的表達(dá)(P<0.01),用PD98059預(yù)處理則p-ERK1/

13、2的表達(dá)明顯被抑制(P<0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 1.200μmol/LH2O2作用6h制備H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞氧化損傷模型,細(xì)胞存活率降低程度適中,重復(fù)性好,模型建立成功。
　　 2.10mg/L及20mg/L的AST使H2O2損傷的H9c2細(xì)胞存活率提高,細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性降低、T-SOD及Mn-SOD活力升高、MDA含量減少,說明高、低劑量的AST均能抗H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞氧化損傷。