Visfatin通過ERK1-2信號通路及自噬途徑引起H9C2細胞肥大分子機制.pdf

1、背景：心肌肥厚是心臟對各種原因引起的血流動力學超負荷的一種基本的適應性反應，以細胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成增高和細胞體積變大為主要特征。其初期有一定代償意義，但最終引起的心肌肥厚及重構(gòu)可導致心力衰竭，而且已成為導致心血管發(fā)病率和死亡率顯著增高的獨立危險因素。2005年，日本學者Fukuhara等[2]發(fā)現(xiàn)一種與PBEF(pre-B cell colony-enhancing factor)的5’端非編碼區(qū)序列相同的cDNA片段，而且他們后續(xù)還發(fā)現(xiàn)其

2、在人和鼠的腹部內(nèi)臟脂肪組織中有著大量的表達，所以將它命為內(nèi)脂素（Visfatin）。目前，大量的研究表明，其密切關(guān)聯(lián)多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程，如：代謝綜合征、冠心病、2型糖尿病、各種炎性疾病、乳腺腫瘤和缺血性腦卒中等。然而，國內(nèi)外關(guān)于內(nèi)脂素對心肌細胞肥大的影響研究還很少，主要集中于上述疾病的研究。近年來有學者發(fā)現(xiàn)一個極其重要的細胞增殖信號調(diào)節(jié)蛋白—ERK1/2，其作為MAPKs家族中的一個主要成員，廣泛參與細胞的各種生物學反應過程，如增殖

3、與分化、維持形態(tài)、構(gòu)建骨架、凋亡和惡變等。有意思的是，目前已有大量學者發(fā)現(xiàn)，ERK1/2信號通路廣泛參與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程中，他們發(fā)現(xiàn)ERK1/2可以被大部分的肥厚性刺激所激活繼而發(fā)生磷酸化，但其具體作用機制并不是很清晰。自噬(autophagy)，最初解釋為細胞的自我吞噬，目前進一步解釋其是將胞內(nèi)的一些蛋白質(zhì)(受損、變性或衰老)及細胞器輸送到溶酶體，從而利用溶酶體內(nèi)的消化酶類物質(zhì)進行消化降解的過程。廣泛的生物學活性，已引起越來越

4、多科研者的極大興趣。研究已發(fā)現(xiàn)，其與心血管系統(tǒng)疾病有著密切的關(guān)系，如冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、缺血/再灌注損傷、心肌肥厚、心梗、心衰等，但其具體作用及分子機制還不太清楚。仔細比較目前自噬在心血管疾病發(fā)展中的相關(guān)研究，我們不難發(fā)現(xiàn)自噬對心血管疾病的發(fā)生發(fā)展起著雙面作用。自噬在心血管系統(tǒng)中到底扮演著怎樣的角色，它的存在是促進抑或抑制，我們還不能最終確定。鑒于以上研究背景，我們猜測Visfatin對心肌細胞肥大的作用如何？而且，ERK1/2信

5、號通路及自噬是否參與其中及扮演的角色如何？為了解開種種疑惑，我們通過觀察內(nèi)脂素，對體外培養(yǎng)的 H9C2大鼠心肌細胞影響，探討內(nèi)脂素是否會引起心肌細胞肥大，為心肌肥大的發(fā)病機制添加新的思路，為心血管研究領(lǐng)域提供新的治療靶點。
　　目的：通過觀察內(nèi)脂素，對體外培養(yǎng)的H9C2大鼠心肌細胞影響，探討內(nèi)脂素是否會引起心肌細胞肥大，并進一步理清其具體的分子作用機制。
　　方法：通過查閱文獻，得知內(nèi)脂素濃度為100ng/mL時，作用時間4

6、8h時，引起大鼠心肌細胞肥大程度最明顯[12-14]。故在本實驗中，采用內(nèi)脂素濃度為100ng/mL。按照5ug的藥物規(guī)格進行配藥，根據(jù)說明書，用50ulMillilQ水溶解，并進一步加入450ul0.1％BSA，從而得到內(nèi)脂素濃度為100ng/mL。實驗分為四組，對照組；Visfatin組；3-MA+Visfatin組；PD98059+Visfatin組。通過Image-Proplus專業(yè)圖像分析軟件測定心肌細胞的表面積，以檢測內(nèi)脂素

7、對H9C2心肌細胞形態(tài)的影響；提取細胞蛋白，通過BCA蛋白定量方法計算心肌細胞單個蛋白合成量，以檢測內(nèi)脂素對H9C2心肌細胞蛋白合成的影響；通過Western blot方法檢測內(nèi)脂素培養(yǎng)H9C2心肌細胞后，其細胞內(nèi)BNP、?-SMA、LC3B、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達量的變化。
　　結(jié)果：⑴Image-Proplus圖像分析軟件測定心肌細胞表面積的結(jié)果表明：Visfatin引起細胞的表面積明顯增加，與對照組比較有顯著

8、差異(P<0.05)；3-MA及PD98059引起細胞的表面積明顯降低，與Visfatin組比較有顯著差異(P<0.05)。⑵BCA蛋白定量方法的結(jié)果表明：Visfatin引起細胞的單個蛋白合成量明顯增加，與對照組比較有顯著差異(P<0.05)；3-MA及PD98059引起細胞的單個蛋白合成量明顯降低，與Visfatin組比較有顯著差異(P<0.05)。⑶Western blot結(jié)果表明：Visfatin引起p-ERK1/2、LC3B、