睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子通過ERK1-2信號通路對成人成肌細(xì)胞體外分化的研究.pdf

1、成肌細(xì)胞是中胚層來源的組織特異性細(xì)胞，有較強(qiáng)的自我更新能力，在出生后骨骼肌的損傷、修復(fù)和維持中起著重要的作用。隨著成肌細(xì)胞作為自身成體種子細(xì)胞所展示的良好臨床應(yīng)用前景，尋求成肌細(xì)胞體外增殖和分化的調(diào)控因子顯得日益重要。大量研究表明，睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(Ciliary neurotrophic factor，CNTF)對多種類型的神經(jīng)元起著營養(yǎng)、支持和保護(hù)作用，并可調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的體外增殖和分化。近年來，CNTF改善骨骼肌肌力的體內(nèi)作用亦有報

2、道，但是由于它所具有的神經(jīng)營養(yǎng)特性，使這種體內(nèi)效應(yīng)是否產(chǎn)生于CNTF對骨骼肌纖維的直接作用，尚無定論。 在本研究中，我們改進(jìn)了傳統(tǒng)的成肌細(xì)胞的分離技術(shù)，利用了新的成人成肌細(xì)胞快速高效分離方法。采用這種新方法，進(jìn)行了成人成肌細(xì)胞的單克隆擴(kuò)增。形態(tài)和免疫細(xì)胞化學(xué)分析顯示，單克隆成肌細(xì)胞具有良好的均一性。并且，這些單克隆成肌細(xì)胞能以平均23.6±4.8h的倍增速度擴(kuò)增，傳代25代以上并保持其正常表型。因此，我們不僅建立了一種新的成人成

3、肌細(xì)胞快速高效分離方法，并且提供了一個體外研究成人成肌細(xì)胞的良好培養(yǎng)體系，為研究外源性刺激因素對成人成肌細(xì)胞的體外影響及其機(jī)理奠定了實驗基礎(chǔ)。 我們將CNTF加到培養(yǎng)的單克隆成人成肌細(xì)胞低血清分化液中，觀察了CNTF對成肌細(xì)胞體外分化的影響及p42/p44-MAPK信號通路在其中的作用。結(jié)果顯示，不高于10ng/mL劑量的重組人CNTF能可逆地抑制成人成肌細(xì)胞的體外成肌分化，并且這種抑制作用具有劑量依賴性。伴隨這種抑制作用產(chǎn)生的

4、未分化成肌細(xì)胞，在形態(tài)和分子水平上與以前已定義的“儲備細(xì)胞”(Reserve cells)相似。p42/p44-MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路阻斷劑PD098059，可取消CNTF的這種抑制作用。以上結(jié)果表明，CNTF能通過激活p42/p44-MAPK信號通路誘導(dǎo)“儲備細(xì)胞”增加，從而抑制成人成肌細(xì)胞的體外分化。我們的研究揭示，CNTF可能是一種新的成人骨骼肌成肌細(xì)胞體外分化的負(fù)調(diào)節(jié)因子，它可通過ERK1/2信號通路誘導(dǎo)“儲備細(xì)胞”增加抑制成人成

5、肌細(xì)胞的體外分化，在肌萎縮和肌損傷的自體修復(fù)治療中有重要的意義。 綜上所述，在本課題研究中，我們利用一種新的成人成肌細(xì)胞快速高效分離方法，獲得了表型均一、穩(wěn)定的單克隆株系，提供了一個研究外源性因素對成人成肌細(xì)胞影響的良好培養(yǎng)體系。本研究中發(fā)現(xiàn)：1．較低濃度(<10ng/mL)的重組人CNTF是一種新的成人骨骼肌成肌細(xì)胞體外成肌分化的負(fù)調(diào)節(jié)因子，并可用于批量獲取“儲備細(xì)胞”。2.我們的結(jié)果首次揭示了，外源性rhCNTF可通過ERK