ERK1-2和P38MAPK通路在BMP9誘導(dǎo)C3H10T1-2細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化中的作用.pdf

1、第一部分：pAdEasyBMP9和pAdEasyGFP的擴(kuò)增，C3H10T1/2細(xì)胞的誘導(dǎo)
　　目的：利用HEK293細(xì)胞擴(kuò)增收集高滴度pAdEasyBMP9和pAdEasyGFP，以此誘導(dǎo)C3H10T1/2細(xì)胞使之呈BMP9高表達(dá)。
　　方法：利用HEK293細(xì)胞，反復(fù)擴(kuò)增后收集得到高滴度pAdEasyGFP和pAdEasyBMP9。當(dāng)C3H10T1/2細(xì)胞生長(zhǎng)融合至60％左右時(shí)，加入AdEasyGFP和AdEasyBMP

2、9誘導(dǎo)細(xì)胞，8小時(shí)后換液，倒置顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白，流式細(xì)胞術(shù)測(cè)誘導(dǎo)效率。
　　結(jié)果：反復(fù)擴(kuò)增后得到高滴度AdEasyGFP和AdEasyBMP9。AdEasyBMP9誘導(dǎo)C3H10T1/2細(xì)胞24小時(shí)和21天誘導(dǎo)率效率分別為59.99％和42.16％。
　　結(jié)論：反復(fù)擴(kuò)增HEK293細(xì)胞可得到高滴度AdEasyGFP和AdEasyBMP9，AdEasyGFP和AdEasyBMP9誘導(dǎo)C3H10T1/2細(xì)胞后可使其高表達(dá)

3、GFP和BMP9。
　　第二部分：ERKI/2和P38MAPK通路在BMP9誘導(dǎo)C3H10T1/2細(xì)胞分化過程中的激活
　　目的：研究ERK1/2和p38MAPK通路在BMP9誘導(dǎo)C3H10T1/2細(xì)胞分化過程中的激活。
　　方法：免疫印跡檢測(cè)經(jīng)pAdEasyBMP9誘導(dǎo)24小時(shí)的C3H10T1/2細(xì)胞phospho-ERK1/2和ERK1/2、phospho-P38MAPK和P38MAPK的表達(dá)，免疫熒光定位phos

4、pho-ERK1/2、phospho-P38MAPK。
　　結(jié)果：
　　1.pAdEasyBMP9促進(jìn)phospho-ERK1/2、phospho-P38MAPK的表達(dá)增高，卻不影響ERK1/2、P38MAPK的表達(dá)水平；
　　2.經(jīng)pAdEasyBMP9誘導(dǎo)前的C3H10T1/2細(xì)胞和經(jīng)pAdEasyGFP誘導(dǎo)的C3H10T1/2細(xì)胞，phospho-ERK1/2和phospho-P38MAPK彌散分布于整個(gè)細(xì)胞內(nèi)；

5、pAdEasyBMP9誘導(dǎo)C3H10T1/2細(xì)胞24小時(shí)，phospho-ERK1/2有從胞漿到胞核移動(dòng)、表達(dá)于胞核的不同狀態(tài)；phospho-P38MAPK有表達(dá)于胞漿和胞核、僅表達(dá)于胞核的不同狀態(tài)。
　　結(jié)論：pAdEasyBMP9誘導(dǎo)C3H10T1/2細(xì)胞分化過程中能夠激活ERK1/2和P38MAPK通路。
　　第三部分：ERK1/2和P38MAPK通路在BMP9誘導(dǎo)C3H10T1/2細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化過程中的作用<

6、br>　　目的：研究ERK1/2和P38MAPK通路在BMP9誘導(dǎo)C3H10T1/2細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化過程中的作用。
　　方法：U0126和SB203580分別阻斷C3H10T1/2細(xì)胞ERK1/2和P38MAPK通路，pAdEasyBMP9誘導(dǎo)21天時(shí)免疫印跡檢測(cè)心肌特異性蛋白CX43，cTnT的表達(dá)，免疫熒光檢測(cè)心肌特異性蛋白cTnT、α-MHC的表達(dá)，Q-RT-PCR檢測(cè)心肌特異性基因GATA4，MEF2C的表達(dá)。