PFT-α和BMP-2聯(lián)合誘導(dǎo)大鼠BMMSCs向心肌樣細(xì)胞分化的研究.pdf

1、研究背景
　　缺血性心臟病(IschemiaHeartDisease,IHD)引發(fā)的心力衰竭(HeartFailure,HF)呈逐年上升趨勢。患者如果沒能得到及時(shí)有效的治療,心肌細(xì)胞則會(huì)出現(xiàn)大范圍地變性、壞死,從而引起各種并發(fā)癥和嚴(yán)重后果的發(fā)生,嚴(yán)重威脅著人類的生命和生活質(zhì)量。一般認(rèn)為,心肌細(xì)胞是終末細(xì)胞,損傷后不能再生,即使能夠再生,每年更新率不到1％。一旦出現(xiàn)心肌組織大范圍受損,目前的藥物治療只能控制癥狀,延緩病情的惡化,并不

2、能修復(fù)和根治終末期心衰。心臟移植是一種有效的治療方法,但存在供體來源有限,免疫排斥,費(fèi)用昂貴等一系列問題,不能廣泛應(yīng)用于臨床,因此尋找新的治療方法一直是研究人員追尋的目標(biāo)。細(xì)胞移植成為近年來治療IHD的熱點(diǎn),并飛速發(fā)展。干細(xì)胞誘導(dǎo)分化并用于治療心肌梗死的臨床研究正在如火如荼的進(jìn)行中,但其分化率較低仍是目前需要解決的主要問題。
　　研究目的
　　1.探討體外分離、培養(yǎng)和純化BMMSCs的方法并改進(jìn)技術(shù)。
　　2.研究PF

3、T-α和BMP-2聯(lián)合誘導(dǎo)BMMSCs向心肌樣細(xì)胞分化的作用。
　　研究方法
　　1.BMMSCs體外分離、培養(yǎng)及鑒定:沖洗大鼠四肢長骨得骨髓沖洗液,采用差速貼壁法和密度梯度離心法相結(jié)合的方法分離出BMMSCs,通過傳代培養(yǎng)來純化細(xì)胞。流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法測定細(xì)胞表面陰性抗原CD45和陽性抗原CD44、CD29表達(dá)情況。顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞的生長狀況,記錄形態(tài)并拍照。
　　2.PFT-α和BMP-2聯(lián)合誘導(dǎo)BMMSCs向心肌

4、樣細(xì)胞分化作用的測定:選取第4代BMMSCs進(jìn)行誘導(dǎo)分化。實(shí)驗(yàn)分組如下:Control組(完全培養(yǎng)液)、PFT-α組(20μmol/L)、BMP-2組(10μg/L)、PFT-α+BMP-2組(PFT-α:20μmol/L,BMP-2:10μg/L)。前3組誘導(dǎo)24h后換完全培養(yǎng)液,PFT-α+BMP-2組誘導(dǎo)48h后換完全培養(yǎng)液。誘導(dǎo)結(jié)束即刻用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法測定細(xì)胞凋亡情況。免疫熒光染色法和蛋白免疫印跡法測定細(xì)胞Cx43、cTnI表達(dá)

5、情況;流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法測定各組心肌樣細(xì)胞的分化。
　　研究結(jié)果
　　1.體外培養(yǎng)BMMSCs的形態(tài)學(xué)特征及鑒定:即刻分離的原代細(xì)胞體積小,透亮,折光性強(qiáng);3d時(shí)細(xì)胞貼壁,形態(tài)多樣,表現(xiàn)為橢圓形、星形、梭形、不規(guī)則形等;1w時(shí)細(xì)胞排列規(guī)則,呈集落樣成長;細(xì)胞傳代后的體積增大,表現(xiàn)為長梭形,核漿比增大。流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法測定BMMSCs表面抗原陽性率,結(jié)果分別為:CD29(93.77±2.440)%;CD44(93.03±1.10)%

6、;CD45(1.97±0.74)%。
　　2.PFT-α和BMP-2聯(lián)合誘導(dǎo)BMMSCs向心肌樣細(xì)胞分化作用:誘導(dǎo)后細(xì)胞凋亡結(jié)果:Control組、PFT-α組、BMP-2組和PFT-α+BMP-2組Q3分別為(89.34±3.18)%、(55.55±5.32)%、(80.44±4.34)%、(70.33±2.61)%。BMP-2組與Control組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P≥0.05),其余各組之間均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。W

7、esternBlot測定結(jié)果,Cx43表達(dá):1w時(shí),Control組、PFT-α組、BMP-2組和PFT-α+BMP-2組灰度值比值分別為(0.153±0.068)、(0.313±0.036)、(0.263±0.024)、(0.394±0.054);Control組低于誘導(dǎo)組(P<0.01),PFT-α+BMP-2組高于其它實(shí)驗(yàn)組(P<0.05),PFT-α組和BMP-2組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P≥0.05)。4w時(shí),Control組、PF

8、T-α組、BMP-2組和PFT-α+BMP-2組灰度值比值分別為(0.342±0.038)、(0.763±0.053)、(0.627±0.083)、(1.065±0.048);Control組低于誘導(dǎo)組(P<0.01),PFT-α+BMP-2組高于其它實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)。cTnI表達(dá):1w時(shí),Control組、PFT-α組、BMP-2組和PFT-α+BMP-2組灰度值比值分別為(0.034±0.001)、(0.263±0.026)、

9、(0.193±0.033)、(0.394±0.045);Control組低于誘導(dǎo)組(P<0.01),PFT-α+BMP-2組高于其它實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)。4w時(shí),Control組、PFT-α組、BMP-2組和PFT-α+BMP-2組灰度值比值分別為(0.072±0.014)、(0.646±0.043)、(0.546±0.029)、(0.877±0.037);Control組低于誘導(dǎo)組(P<0.01),PFT-α+BMP-2組高于其它實(shí)

10、驗(yàn)組(P<0.05)。免疫熒光染色鑒定結(jié)果:Cx43表達(dá):1w時(shí),Control組無表達(dá),誘導(dǎo)組微弱表達(dá);4w時(shí),Control組微弱表達(dá),誘導(dǎo)組表達(dá)增強(qiáng)。cTnI表達(dá):1w時(shí),Control組無表達(dá),誘導(dǎo)組微弱表達(dá);4w時(shí),Control組仍無表達(dá),誘導(dǎo)組表達(dá)增強(qiáng)。分化率結(jié)果:Control組、PFT-α組、BMP-2組和PFT-α+BMP-2組分化率分別為(2.04±1.63)%、(26.96±1.90)%、(16.53±2.63)

11、%、(38.48±2.44)%;Control組低于誘導(dǎo)組(P<0.01),PFT-α+BMP-2組高于其他實(shí)驗(yàn)組(P<0.01)。
　　研究結(jié)論
　　1.聯(lián)合差速貼壁法和密度梯度離心法能夠獲得大量BMMSCs,通過傳代能夠得到純度較高的BMMSCs。
　　2.PFT-α聯(lián)合BMP-2誘導(dǎo)BMMSCs可使其向心肌樣細(xì)胞分化,并表現(xiàn)出與正常心肌細(xì)胞類似的生物學(xué)特性,其細(xì)胞分化率明顯高于PFT-α或BMP-2單獨(dú)誘導(dǎo)。PF