BMP-2、FGF-2對(duì)大鼠觸須毛乳頭細(xì)胞增殖和毛發(fā)誘導(dǎo)能力的影響.pdf

1、前言：
　　 近年來,脫發(fā)患者日益增多,它雖然不是致命性疾病,但給患者心理和日常生活交際帶來的困擾是不可忽略的。臨床上對(duì)于脫發(fā)的治療歷來都是醫(yī)生所面對(duì)的棘手問題,并且療效難盡人意。為克服這些困難,有學(xué)者提出毛囊細(xì)胞移植(follicularcellimplantation,FCI)治療脫發(fā),即通過將體外培養(yǎng)擴(kuò)增的毛囊細(xì)胞植入脫發(fā)區(qū)來實(shí)現(xiàn)治療目的。毛囊主要由表皮和真皮兩種細(xì)胞成分組成,分別為上皮源性和間充質(zhì)源性,兩者通過相互間的信

2、號(hào)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)著毛囊的形成、生長發(fā)育和周期性生長。其中,毛乳頭細(xì)胞作為毛囊的真皮組分,在表皮和真皮的復(fù)雜信號(hào)聯(lián)系中起著主導(dǎo)作用。故毛乳頭細(xì)胞可以作為脫發(fā)細(xì)胞治療的一個(gè)重要細(xì)胞來源,已有學(xué)者實(shí)驗(yàn)證實(shí)了將毛乳頭細(xì)胞單獨(dú)或聯(lián)合其它毛囊相關(guān)細(xì)胞植入無毛區(qū),可誘導(dǎo)毛囊和毛發(fā)的再生。
　　 毛乳頭在毛囊內(nèi)的位置隱蔽,這給體外分離帶來很多困難,目前主要有顯微機(jī)械分離法、酶分法和采用流式細(xì)胞儀技術(shù)分離毛乳頭細(xì)胞三種分離方法,各有利弊。
　　

3、 毛乳頭細(xì)胞的鑒定可以通過其表達(dá)的一些特征性的分子實(shí)現(xiàn),其中檢測堿性磷酸酶活性最為普遍,它還可以作為毛乳頭誘導(dǎo)毛發(fā)生長能力的評(píng)價(jià)指標(biāo),體內(nèi)試驗(yàn)已證實(shí)了堿性磷酸酶與毛乳頭細(xì)胞誘導(dǎo)毛發(fā)生長能力呈線性相關(guān)。
　　 體外培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞生長緩慢,并且其毛發(fā)誘導(dǎo)能力也會(huì)隨著傳代次數(shù)增多而下降,這限制了毛囊細(xì)胞療法的推廣應(yīng)用。因毛乳頭的生長和誘導(dǎo)毛發(fā)生長的能力有賴于所處環(huán)境中各種分子的調(diào)控,故推測在體外培養(yǎng)體系中,外源補(bǔ)給這些因子或是增強(qiáng)它

4、們的內(nèi)源產(chǎn)生有助于促進(jìn)毛乳頭細(xì)胞的生長及其誘導(dǎo)毛發(fā)生長能力的保持。有學(xué)者提出骨形成蛋白(Bonemorphogeneticproteins,BMP)可以顯著增加毛乳頭細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶的表達(dá),當(dāng)敲除毛乳頭細(xì)胞內(nèi)的骨形成蛋白受體后,堿性磷酸酶的表達(dá)及毛乳頭誘導(dǎo)毛發(fā)生長的能力均消失,說明骨形成蛋白對(duì)毛乳頭的誘導(dǎo)毛發(fā)生長能力有促進(jìn)作用。也有學(xué)者提出在培養(yǎng)體系內(nèi)加入成纖維細(xì)胞生長因子-2(fibroblastgrowthfactorbasic,F

5、GF-2)可抵消毛乳頭細(xì)胞體外增殖緩慢的作用。
　　 毛乳頭細(xì)胞可分泌胰島素樣生長因子(Insulin-likegrowthfactor-1,IGF-1),它可促進(jìn)毛囊上皮細(xì)胞的增生和遷移等,進(jìn)而促進(jìn)毛發(fā)的再生,因此在眾多的促進(jìn)毛發(fā)再生和生長的實(shí)驗(yàn)中,胰島素樣生長因子-1常被作為檢測指標(biāo)。
　　 本研究以大鼠觸須毛乳頭細(xì)胞為研究對(duì)象,探討骨形成蛋白-2和成纖維細(xì)胞生長因子-2單獨(dú)及聯(lián)合作用對(duì)毛乳頭細(xì)胞增殖和毛發(fā)誘導(dǎo)能力的

6、影響,以及骨形成蛋白-2是否通過胰島素樣生長因子-1促進(jìn)毛發(fā)再生。
　　 方法：
　　 1、采用顯微機(jī)械分離法對(duì)大鼠觸須毛乳頭進(jìn)行分離,組織塊培養(yǎng)法進(jìn)行毛乳頭細(xì)胞的原代培養(yǎng)。
　　 2、以單克隆堿性磷酸酶抗體為一抗,對(duì)原代培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光鑒定,以空白對(duì)照和成纖維細(xì)胞組為對(duì)照。
　　 3、骨形成蛋白-2與成纖維細(xì)胞生長因子-2單獨(dú)及聯(lián)合作用:
　　 BMP-2組:細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)分別加入終濃

7、度為0、50、100、200ng/ml的BMP-2;
　　 FGF-2組:細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)分別加入終濃度為0、5、10、20ng/ml的FGF-2;
　　 BMP-2和FGF-2聯(lián)合組:實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)加入100ng/mlBMP-2和10ng/ml;
　　 FGF-2,對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)無BMP-2和FGF-2。
　　 4、采用CCK-8法檢測毛乳頭細(xì)胞增殖活性。
　　 5、采用堿性磷酸酶活性測試盒

8、檢測毛乳頭細(xì)胞的堿性磷酸酶活性。
　　 6、毛乳頭細(xì)胞分別被濃度為0、50、100、200ng/mlBMP-2作用后,采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)IGF-1的水平。
　　 結(jié)果：
　　 1、剛分離出的毛乳頭呈梨形,毛乳頭細(xì)胞的原代培養(yǎng)大約需要2周,細(xì)胞生長具有聚集性特征。
　　 2、毛乳頭細(xì)胞免疫熒光染色陽性,而空白對(duì)照組和成纖維細(xì)胞組的免疫熒光染色陰性。
　　 3、毛乳頭細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果:

9、
　　 BMP-2組:BMP-2對(duì)毛乳頭細(xì)胞的增殖無影響;
　　 FGF-2組:FGF-2可以促進(jìn)毛乳頭細(xì)胞的增殖,且呈濃度依賴性;
　　 BMP-2聯(lián)合FGF-2組:BMP-2聯(lián)合FGF-2可以促進(jìn)毛乳頭細(xì)胞增殖,且呈時(shí)間依賴性。
　　 4、毛乳頭細(xì)胞堿性磷酸酶活性檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 BMP-2組:BMP-2增強(qiáng)毛乳頭細(xì)胞堿性磷酸酶活性,且呈濃度依賴性;
　　 FGF-2組:FGF-2

10、減弱毛乳頭細(xì)胞堿性磷酸酶活性,且呈濃度依賴性;
　　 BMP-2聯(lián)合FGF-2組:100ng/mlBMP-2聯(lián)合10ng/mlFGF-2可以增強(qiáng)毛乳頭細(xì)胞的堿性磷酸酶活性,且呈時(shí)間依賴性。
　　 5、BMP-2可以增加毛乳頭細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IGF-1的水平,且呈濃度依賴性。
　　 結(jié)論：
　　 1、本次研究中,我們采用顯微機(jī)械分離法成功分離了大鼠觸須毛乳頭,并經(jīng)免疫熒光鑒定,體外培養(yǎng)毛乳頭細(xì)胞體系成立。<

11、br>　　 2、與BMP-2或FGF-2單獨(dú)作用相比,按適當(dāng)濃度比例聯(lián)合BMP-2和FGF-2,既可以促進(jìn)毛乳頭細(xì)胞的增殖,又可以保持其毛發(fā)誘導(dǎo)能力,故二者可形成互補(bǔ)關(guān)系,滿足脫發(fā)細(xì)胞治療的需要。
　　 3、BMP-2可能通過促進(jìn)毛乳頭細(xì)胞分泌IGF-1,增強(qiáng)毛乳頭細(xì)胞的毛發(fā)誘導(dǎo)能力,對(duì)BMP-2促進(jìn)毛乳頭細(xì)胞毛發(fā)誘導(dǎo)能力的機(jī)制起到了提示作用。
　　 4、BMP-2可以同時(shí)增強(qiáng)毛乳頭細(xì)胞的堿性磷酸酶活性和IGF-1的表