BMP-2對骨髓源性心肌干細(xì)胞向心肌分化的作用及受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制.pdf

1、目的:建立骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MMSC)的單細(xì)胞克隆，篩選具有特異性心肌分化潛能的骨髓源性心肌干細(xì)胞(MCSC)，研究BMP-2對MCSC向心肌分化的作用及受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。方法:從SD大鼠骨髓中分離MMSC，采用單細(xì)胞克隆培養(yǎng)技術(shù)，c-kit免疫熒光標(biāo)記和RT-PCR檢測心肌早期轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，從MMSC中篩選MCSC。在體外用BMP-2誘導(dǎo)MCSC向心肌定向分化。RT-PCR檢測誘導(dǎo)前后BMP-2受體BMPRIA和BMPRII、心肌早

2、期轉(zhuǎn)錄因子NKx2．5和GATA-4以及cTnT和Cx-43mRNA的表達(dá)。取誘導(dǎo)后不同時(shí)間的細(xì)胞作cTnT和Cx-43免疫細(xì)胞化學(xué)染色。用Fluo-3AM標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)Ca2+，在共聚焦激光掃描顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平。取不同發(fā)育期和成熟SD大鼠的心肌組織，采用RT-PCR和免疫組織化學(xué)染色，檢測心肌細(xì)胞內(nèi)cTnT和Cx-43mRNA及其蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果:通過單細(xì)胞克隆培養(yǎng)技術(shù)，從骨髓中建立了多個(gè)MMSC單細(xì)胞克隆。c-kit免

3、疫熒光染色顯示，c-kit+MMSC克隆大多為成纖維細(xì)胞樣克隆。RT-PCR檢測顯示，c-kit+MMSC克隆低表達(dá)心肌早期形成轉(zhuǎn)錄因子Nkx2．5和GATA-4。從MMSC克隆中篩選出具有心肌特異分化潛能的c-kit+MMSC克隆即為MCSC。在體外，用BMP-2誘導(dǎo)MCSC向心肌分化后，相差顯微鏡下觀察到，從誘導(dǎo)后l周開始細(xì)胞的形態(tài)和排列發(fā)生變化。心肌早期形成轉(zhuǎn)錄因子Nkx2．5和GATA-4的表達(dá)從誘導(dǎo)后1周開始增加，3～4周表達(dá)

4、明顯。cTnT和Cx-43mRNA在誘導(dǎo)前的MCSC中未見表達(dá)，誘導(dǎo)后1周的細(xì)胞開始表達(dá)，3～4周表達(dá)明顯。cTnT和Cx-43蛋白從誘導(dǎo)后2周開始表達(dá)，3～4周表達(dá)增強(qiáng)。cTnT呈密集的橫紋樣結(jié)構(gòu)。Cx-43呈顆粒狀，誘導(dǎo)后2周分布于細(xì)胞膜下，從3周開始逐漸集中分布于相鄰細(xì)胞連接處。在共聚焦激光掃描顯微鏡下，可見分化細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平呈周期性變化，加入異丙腎上腺素后，細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平明顯升高，周期性變化加快。大鼠心肌組織的RT-PC

5、R檢測結(jié)果顯示，cTnTmRNA表達(dá)自胚胎期第11天開始到成年大鼠不斷上升，Cx-43mRNA表達(dá)自胚胎期逐漸增加，至出生后7天達(dá)高峰，以后逐漸降低，17天后表達(dá)趨于穩(wěn)定。胚胎第14天大鼠的心肌細(xì)胞排列不規(guī)則，出生后逐漸趨向規(guī)則排列。cTnT蛋白的表達(dá)從胚胎到成年逐漸增加。Cx-43蛋白在胚胎第14天大鼠主要分布在小梁的心室肌細(xì)胞內(nèi)，第21天見于所有心室肌細(xì)胞。Cx-43蛋白呈顆粒狀，多位于細(xì)胞膜下。出生后Cx-43的表達(dá)逐漸增強(qiáng)，幼年