骨髓源性心肌干細胞的年齡性變化以及IGF-1對干細胞衰老的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、目的：研究不同年齡大鼠MCSCs超微結(jié)構和衰老相關指標的差異,明確年齡因素對MCSCs增殖、存活和向心肌細胞分化的影響,探討IGF-1對干細胞衰老的調(diào)節(jié)作用及其機制。
　　 方法：從幼年、成年和老年雄性SD大鼠骨髓中分離MMSCs,通過單克隆培養(yǎng)技術、c-kit免疫熒光標記和RT-PCR檢測心肌早期轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5的表達,從MMSCs中篩選出具有心肌特異分化潛能的MCSCs。透射電鏡下觀察細胞超微結(jié)構改變。SA-β-半乳糖苷

2、酶染色和ROS染色檢測細胞衰老變化,流式細胞術分析細胞周期。建立體外無血清缺氧模型,Annexin V/PI雙標流式細胞術和Hochest33342染色檢測MCSCs存活和凋亡。用BMP-2誘導不同年齡組MCSCs向心肌細胞分化,RT-PCR檢測誘導后細胞心肌早期轉(zhuǎn)錄因子和心肌特異基因的表達,免疫細胞化學染色檢測各年齡組細胞經(jīng)BMP-2誘導后細胞內(nèi)cTnT表達的變化。用IGF-1處理老年組MCSCs,SA-β-半乳糖苷酶染色和ROS染色

3、檢測細胞衰老指標差異,流式細胞儀分析細胞周期。Hochest33342染色檢測IGF-1處理前后,老年組MCSCs在無血清缺氧培養(yǎng)條件下凋亡細胞比例。用BMP-2誘導各實驗組MCSCs向心肌細胞定向分化,RT-PCR檢測誘導后細胞Nkx2.5、GATA-4和cTnT、Cx-43 mRNA的表達,免疫細胞化學染色檢測細胞內(nèi)cTnT表達的變化。通過RT-PCR檢測IGF-1處理前后細胞中p53、p21和bax mRNA的表達變化以及細胞VE

4、GF、HGF和FGF mRNA的表達差異。
　　 結(jié)果：從MMSCs克隆中篩選出表達心肌早期轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5的c-kit+ MMSCs克隆。透射電鏡顯示老年組MCSCs核漿比減小,胞漿內(nèi)髓樣小體增多。隨著年齡增長,處于增殖期的MCSCs比例下降,β-半乳糖苷酶和ROS陽性細胞數(shù)目增多。在無血清缺氧條件下培養(yǎng)12 h后,老年組凋亡細胞比例明顯高于幼年組。用BMP-2誘導后4周,幼年組細胞的Nkx2.5、GATA-4和cTnT、

5、Cx-43 mRNA表達明顯,成年組和老年組細胞表達低于幼年組,差異有顯著性意義。免疫細胞化學染色顯示,BMP-2誘導后幼年組細胞cTnT表達明顯,老年組細胞表達較弱。老年組MCSCs經(jīng)IGF-1處理后,β-半乳糖苷酶陽性細胞數(shù)目和ROS陽性細胞數(shù)目減少,處于增殖期的細胞比例明顯增高。在無血清缺氧條件下培養(yǎng)12 h后,老年IGF-1處理組MCSCs凋亡細胞比例較未處理組下降,差異有顯著性意義。用BMP-2誘導后4周,老年IGF-1處理組