骨髓源性心肌干細(xì)胞的年齡性變化以及IGF-1對(duì)干細(xì)胞衰老的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、目的：研究不同年齡大鼠MCSCs超微結(jié)構(gòu)和衰老相關(guān)指標(biāo)的差異,明確年齡因素對(duì)MCSCs增殖、存活和向心肌細(xì)胞分化的影響,探討IGF-1對(duì)干細(xì)胞衰老的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制。
　　 方法：從幼年、成年和老年雄性SD大鼠骨髓中分離MMSCs,通過單克隆培養(yǎng)技術(shù)、c-kit免疫熒光標(biāo)記和RT-PCR檢測(cè)心肌早期轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5的表達(dá),從MMSCs中篩選出具有心肌特異分化潛能的MCSCs。透射電鏡下觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變。SA-β-半乳糖苷

2、酶染色和ROS染色檢測(cè)細(xì)胞衰老變化,流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期。建立體外無血清缺氧模型,Annexin V/PI雙標(biāo)流式細(xì)胞術(shù)和Hochest33342染色檢測(cè)MCSCs存活和凋亡。用BMP-2誘導(dǎo)不同年齡組MCSCs向心肌細(xì)胞分化,RT-PCR檢測(cè)誘導(dǎo)后細(xì)胞心肌早期轉(zhuǎn)錄因子和心肌特異基因的表達(dá),免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)各年齡組細(xì)胞經(jīng)BMP-2誘導(dǎo)后細(xì)胞內(nèi)cTnT表達(dá)的變化。用IGF-1處理老年組MCSCs,SA-β-半乳糖苷酶染色和ROS染色

3、檢測(cè)細(xì)胞衰老指標(biāo)差異,流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期。Hochest33342染色檢測(cè)IGF-1處理前后,老年組MCSCs在無血清缺氧培養(yǎng)條件下凋亡細(xì)胞比例。用BMP-2誘導(dǎo)各實(shí)驗(yàn)組MCSCs向心肌細(xì)胞定向分化,RT-PCR檢測(cè)誘導(dǎo)后細(xì)胞Nkx2.5、GATA-4和cTnT、Cx-43 mRNA的表達(dá),免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)cTnT表達(dá)的變化。通過RT-PCR檢測(cè)IGF-1處理前后細(xì)胞中p53、p21和bax mRNA的表達(dá)變化以及細(xì)胞VE

4、GF、HGF和FGF mRNA的表達(dá)差異。
　　 結(jié)果：從MMSCs克隆中篩選出表達(dá)心肌早期轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5的c-kit+ MMSCs克隆。透射電鏡顯示老年組MCSCs核漿比減小,胞漿內(nèi)髓樣小體增多。隨著年齡增長(zhǎng),處于增殖期的MCSCs比例下降,β-半乳糖苷酶和ROS陽性細(xì)胞數(shù)目增多。在無血清缺氧條件下培養(yǎng)12 h后,老年組凋亡細(xì)胞比例明顯高于幼年組。用BMP-2誘導(dǎo)后4周,幼年組細(xì)胞的Nkx2.5、GATA-4和cTnT、

5、Cx-43 mRNA表達(dá)明顯,成年組和老年組細(xì)胞表達(dá)低于幼年組,差異有顯著性意義。免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示,BMP-2誘導(dǎo)后幼年組細(xì)胞cTnT表達(dá)明顯,老年組細(xì)胞表達(dá)較弱。老年組MCSCs經(jīng)IGF-1處理后,β-半乳糖苷酶陽性細(xì)胞數(shù)目和ROS陽性細(xì)胞數(shù)目減少,處于增殖期的細(xì)胞比例明顯增高。在無血清缺氧條件下培養(yǎng)12 h后,老年IGF-1處理組MCSCs凋亡細(xì)胞比例較未處理組下降,差異有顯著性意義。用BMP-2誘導(dǎo)后4周,老年IGF-1處理組