拉伸加載裝置的研制及拉伸對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）是中胚層來(lái)源的具有多向分化潛能的干細(xì)胞，存在于不同種屬的動(dòng)物體內(nèi)（如雞、鼠、兔、犬、人），主要分布在全身的結(jié)締組織及組織器官中，以骨髓組織中的含量最為豐富。在不同的誘導(dǎo)條件下，MSCs具有向成骨細(xì)胞、成肌細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞等中胚層細(xì)胞分化的能力，同時(shí)還可分化為外胚層的神經(jīng)細(xì)胞和內(nèi)胚層的肝細(xì)胞。隨著組織細(xì)胞工程學(xué)和基因工程學(xué)的發(fā)展，利用MSCs的多向分化的潛能，將其運(yùn)用于組織工程、細(xì)胞因子替代

2、治療、基因治療、細(xì)胞移植及器官移植等方面的研究已成為熱點(diǎn)。 然而，MSCs在體內(nèi)含量很少，骨髓中每10萬(wàn)單核細(xì)胞中大約有1個(gè)MSCs，且隨著年齡的增長(zhǎng)，MSCs數(shù)量逐漸減少。顯然，如此微量的MSCs根本難以滿足細(xì)胞工程的需要。因此，如何摸索一個(gè)適宜的體外純化、擴(kuò)增的培養(yǎng)條件，對(duì)于進(jìn)一步研究MSCs的生物學(xué)特性、誘導(dǎo)分化和細(xì)胞移植就顯得尤為重要。 體外調(diào)節(jié)MSCs增殖的方法有很多種，其中力學(xué)刺激是一種重要的途徑。近年來(lái)，力

3、學(xué)因素對(duì)細(xì)胞和組織生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)節(jié)一直是生物力學(xué)十分重視的研究領(lǐng)域，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)在這一領(lǐng)域作了大量的研究工作，積累了豐富的研究經(jīng)驗(yàn)。拉伸是力學(xué)刺激中的一種有效方法，文獻(xiàn)顯示：最佳刺激條件的拉伸能促進(jìn)細(xì)胞增殖。但目前利用力學(xué)拉伸加載作用調(diào)節(jié)MSCs增殖的研究尚未見(jiàn)詳細(xì)文獻(xiàn)報(bào)道，其機(jī)理更不清楚。本實(shí)驗(yàn)擬研制拉伸加載裝置，選取大鼠作為實(shí)驗(yàn)材料，進(jìn)行MSCs的原代分離、培養(yǎng)、鑒定。然后在一定條件下對(duì)MSCs的進(jìn)行拉伸刺激，研究分析拉伸刺激后MS

4、Cs的增殖情況，從中找到在設(shè)定范圍內(nèi)，該拉伸裝置刺激MSCs增殖的最佳條件，并為以后MSCs在力學(xué)拉伸刺激下的定向分化及進(jìn)一步研究打下良好基礎(chǔ)。 本實(shí)驗(yàn)的研究方法和主要研究?jī)?nèi)容包括：首先，研制一套符合實(shí)驗(yàn)要求的拉伸加載裝置，初步設(shè)定拉伸參數(shù)，進(jìn)行相關(guān)預(yù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)；同時(shí)，選取成年大鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，采用Percoll梯度離心法結(jié)合貼壁篩選法分離提取MSCs，培養(yǎng)傳代，進(jìn)行相關(guān)鑒定；然后使用拉伸加載裝置，在一定的條件下，對(duì)MSCs進(jìn)行拉

5、伸刺激，采用MTT法分析增殖影響，分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)分析與增殖相關(guān)的c-fos基因的表達(dá)變化，從中研究不同的拉伸刺激條件對(duì)MSCs增殖的相應(yīng)影響，并總結(jié)出在設(shè)定的參數(shù)范圍內(nèi)，本實(shí)驗(yàn)研制的拉伸加載裝置刺激MSCs增殖的最佳拉伸條件。 本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果如下： 一、拉伸加載實(shí)驗(yàn)裝置的研制： 根據(jù)圓形基底膜形變拉伸原理，研制了彈性膜周期加載裝置，運(yùn)用數(shù)字電路進(jìn)行控制，LED顯示，參數(shù)易于控制，線性可調(diào)。刺激頻率范圍0.1

6、-1Hz，刺激大小范圍2％-15％，刺激時(shí)間人工調(diào)節(jié)，能滿足實(shí)驗(yàn)要求。 二、MSCs的原代分離和培養(yǎng) 通過(guò)Percoll離心法（Percoll密度為1.073g/mL）得到的單核細(xì)胞24小時(shí)后貼壁，細(xì)胞呈圓形，72小時(shí)后呈紡錘形、梭形、多角形，增殖迅速，原代培養(yǎng)約14-20天左右可達(dá)到80-90％融合。傳代細(xì)胞24小時(shí)內(nèi)完全貼壁，5-7天內(nèi)達(dá)到80-90％融合。傳代至6-8代。運(yùn)用免疫組化方法檢測(cè)了大鼠MSCs的4種表面

7、抗原的表達(dá)情況。結(jié)果顯示：CD34（造血干細(xì)胞標(biāo)記物）陰性；CD44陽(yáng)性；CollagenⅠ陰性；Fibronectin陽(yáng)性。細(xì)胞周期分析：G0/G1細(xì)胞占93.7％，說(shuō)明大部分細(xì)胞處于非增殖狀態(tài)。成骨細(xì)胞誘導(dǎo)液誘導(dǎo)后，細(xì)胞表達(dá)成骨細(xì)胞的標(biāo)志AKP，出現(xiàn)鈣化點(diǎn)，并隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而加深。證明所培養(yǎng)的細(xì)胞為大鼠MSCs。 三、拉伸對(duì)MSCs的增殖影響 在1Hz刺激頻率下，通過(guò)三種刺激時(shí)間（15分鐘、30分鐘、60分鐘），三種

8、刺激大?。?％、4％、8％）的拉伸，MTT結(jié)果顯示：在拉伸刺激下，MSCs有不同程度增殖；方差分析顯示刺激時(shí)間對(duì)MSCs的增殖影響大于刺激大小的影響；在設(shè)定范圍內(nèi)，最佳刺激條件是刺激大小為8％，刺激時(shí)間為60分鐘；分子生物學(xué)技術(shù)分析結(jié)果顯示c-fos基因表達(dá)增強(qiáng)。 通過(guò)分析，可以認(rèn)為本實(shí)驗(yàn)研制的拉伸加載裝置能初步滿足研究需要。而采用Percoll梯度離心法結(jié)合貼壁篩選法可以比較簡(jiǎn)單有效地獲得MSCs，通過(guò)免疫組化方法檢測(cè)表面抗原