機械拉伸對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞遷移行為的調(diào)節(jié)及其相關(guān)分子機理研究.pdf

1、骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells，MSCs)是一類具有增殖和多向分化潛能的特殊細胞，在特定環(huán)境條件下，MSCs可增殖并定向分化為多種細胞。同時，MSCs具有趨化特性，可以響應(yīng)炎癥或組織損傷(包括腫瘤組織)，進行動員、遷移。MSCs在機體組織損傷修復(fù)和再生中具有重要作用，是臨床細胞治療的種子細胞，也是目前應(yīng)用最多的干細胞類型。
　　 機體中的細胞和組織處于復(fù)雜的

2、力學(xué)微環(huán)境中，MSCs在移出骨髓進入外周血循環(huán)的過程中，受到血液流動產(chǎn)生的剪應(yīng)力和張應(yīng)變的影響。力學(xué)因素可調(diào)節(jié)活細胞的生理、病理過程，有關(guān)機械刺激對MSCs增殖、表型和分化影響的報道比較多，相關(guān)的分子機理在深入研究中。但到目前為止，人們對影響MSCs遷移行為的力學(xué)因素及其分子機理還知之甚少。本文試圖揭示機械拉伸對大鼠MSCs(ratMSCs，rMSCs)遷移行為的影響及其相關(guān)分子機理。
　　 本文選用原代分離培養(yǎng)的rMSCs，運

3、用單軸拉伸加載裝置對培養(yǎng)在彈性硅膠膜上的rMSCs施加不同條件(頻率1Hz，形變量5％～15％，拉伸時間4～12 h)的機械拉伸。采用Transwell法和劃痕法評價拉伸前后細胞遷移能力的變化，基于明膠酶譜法檢測基質(zhì)金屬蛋白酶-2，-9(Matrix metalloproteinase-2，-9)表達的變化。用MMPs抑制劑GM6001抑制拉伸刺激對rMSCs MMP-2和MMP-9表達的激活，考察抑制MMP-2和MMP-9對拉伸促進r

4、MSCs的遷移的影響。實驗結(jié)果如下：
　　 ①rMSCs的原代分離、培養(yǎng)及鑒定
　　 本實驗采用Percoll密度梯度離心法，結(jié)合rMSCs的貼壁特性，體外分離、培養(yǎng)rMSCs，rMSCs形狀一致，呈長梭樣、漩渦狀分布。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，rMSCs原代細胞表達CD44和CD90，不表達CD34，與rMSCs表面標記抗原一般規(guī)律一致，說明分離培養(yǎng)的rMSCs表型均一，符合rMSCs特點。
　　 ②機械拉伸加載

5、對rMSCs遷移行為的影響
　　 將細胞培養(yǎng)在彈性硅膠膜上，采用自制的細胞拉伸加載裝置拉伸硅膠膜，對細胞實施加載。運用Transwell法檢測細胞遷移，研究發(fā)現(xiàn)頻率1 Hz、形變量10％、拉伸時間8 h加載條件促進rMSCs的遷移效果較明顯。劃痕實驗進一步說明，頻率1Hz、形變量10％、拉伸時間8 h機械刺激對rMSCs遷移能力有促進作用。
　　 ③MMP-2和MMP-9參與機械拉伸誘導(dǎo)的rMSCs遷移
　　 采

6、用明膠酶譜法檢測頻率1Hz、形變量10％、拉伸時間8 h加載條件下MMP-2和MMP-9活性變化，發(fā)現(xiàn)拉伸加載組，rMSCs中MMP-2和MMP-9活性分別增加到對照組的235％和248％。
　　 在機械拉伸前加入MMP-2和MMP-9抑制劑GM6001，檢測細胞遷移和MMP-2和MMP-9表達變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)25μM GM6001顯著抑制機械刺激誘導(dǎo)的MMP-2和MMP-9分泌增加，同時機械刺激誘導(dǎo)的rMSCs遷移受到抑制。結(jié)果