粘附分子在大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的表達(dá)及其意義.pdf

1、研究背景： 骨髓中除了造血干細(xì)胞(Hematopoietic stem cells，HSCs)以外還有一種干細(xì)胞，由于其來源于間充質(zhì)，并具有間充質(zhì)細(xì)胞的分化潛力，故稱之為間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)；由于其在骨髓中可分化為支持造血細(xì)胞的基質(zhì)細(xì)胞，故又稱之為基質(zhì)干細(xì)胞(Stromal stem cells)。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有可塑性，在特定的條件下可分化為各胚層來源的組

2、織細(xì)胞，稱為橫向分化(transdifferentiation)，這一發(fā)現(xiàn)不僅對(duì)于細(xì)胞生物學(xué)理論的發(fā)展有重大意義，對(duì)于各種因素導(dǎo)致的組織和器官缺損性、退行性病變以及遺傳缺陷性疾病的細(xì)胞替代治療也具有深遠(yuǎn)的影響。另外，由于骨髓MSCs易于分離培養(yǎng)和體外擴(kuò)增，可自體移植無免疫排斥反應(yīng)等特點(diǎn)，因此近年來骨髓MSCs替代治療已成為醫(yī)學(xué)界乃至整個(gè)生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。 目前，骨髓MSCs替代治療方式主要有兩種：一種是自體動(dòng)員，另一種是細(xì)

3、胞移植。不論是動(dòng)員還是移植骨髓MSCs，其與血管內(nèi)皮細(xì)胞或組織細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)的粘附都是其發(fā)揮修復(fù)治療作用首要的一步。因此，探討骨髓MSCs的生物學(xué)及分子學(xué)基礎(chǔ)就顯得尤為重要。研究證明粘附分子在細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)問粘附過程中起著重要的作用，然而其在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá)及其意義目前尚無統(tǒng)一認(rèn)識(shí)。目前，大鼠作為最常用來研究干細(xì)胞分化、移植的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之一，其骨髓MSCs粘附分子表達(dá)的研究報(bào)道甚少。骨髓MSCs分離培養(yǎng)和體外擴(kuò)增是

4、進(jìn)行骨髓MSCs研究的前提，因此，我們?cè)O(shè)計(jì)并進(jìn)行了如下兩部分實(shí)驗(yàn)研究： 第一部分： 細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長特性的影響目的：觀察細(xì)胞外基質(zhì)--多聚賴氨酸對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(rat marrowmesenchymal stem cells，rMSCs)生長特性的影響，探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的提取、分離培養(yǎng)和體外擴(kuò)增的最佳條件。 方法： 采用全骨髓直接貼壁法獲得原代rMSCs，分別接種于涂布和未

5、涂布多聚賴氨酸的培養(yǎng)器皿上，顯微鏡下觀察細(xì)胞生物學(xué)形態(tài)及生長狀態(tài)，計(jì)數(shù)不同時(shí)間細(xì)胞貼壁數(shù)目，流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期。 結(jié)果： rMSCs在用多聚賴氨酸處理過的培養(yǎng)器皿上貼壁、增殖都較普通組快，細(xì)胞形態(tài)好，傳代細(xì)胞呈均一的長梭形，呈漩渦狀或梳狀生長，為典型的MSCs形態(tài)；細(xì)胞活力和長勢(shì)較普通組活躍。 結(jié)論： (1)細(xì)胞外基質(zhì)多聚賴氨酸能明顯促進(jìn)rMSCs的貼壁和增殖，有助于rMSCs的體外擴(kuò)增培養(yǎng)。

6、 (2)本實(shí)驗(yàn)方法能比較容易地獲得大量高純度的MSCs。 第二部分： VCAM-1、ICAM-1在大鼠骨髓問充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá)及其意義目的：探討血管細(xì)胞粘附分子(vascular cell adhesion molecule-l，VCAM-1)與細(xì)胞間粘附分子(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)在大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá)及其意義。 方法： 采用第一部分的培養(yǎng)

7、方法獲得rMSCs，將培養(yǎng)的rMSCs分為兩組，其中一組用濃度為10 ng/ml的TNF-α 12 h，另外一組不加任何細(xì)胞因子作為空白對(duì)照。然后分別采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法從蛋白水平對(duì)VCAM-1和ICAM-1進(jìn)行定位分析，免疫熒光直標(biāo)法在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)細(xì)胞表面VCAM-1、ICAM-1的表達(dá)率，RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞VCAM-1、ICAM-1 mRNA的表達(dá)。 結(jié)果： 生理狀態(tài)下，rMSCs較低表達(dá)VCAM-1，而完全