人類bFGF基因在大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的表達(dá)及其分子作用機(jī)制研究.pdf

1、目的:構(gòu)建bFGF表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染大鼠MSC和大鼠成骨細(xì)胞,RT-PCR半定量研究bFGF表達(dá)與VEGF,LMP-1及BGP基因表達(dá)的關(guān)系.方法:將質(zhì)粒pCI-neo-bFGF轉(zhuǎn)化擴(kuò)增,大量提取及純化.用雙酶切定向構(gòu)建pIRES2-EGFP-bFGF質(zhì)粒表達(dá)載體,擴(kuò)增并酶切鑒定.使用電穿孔儀將攜帶目的基因的pIRES2-EGFP-bFGF轉(zhuǎn)染MSC和大鼠成骨細(xì)胞,熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果,流式細(xì)胞儀(flow cytometry,FCM)

2、檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率,RT-PCR鑒定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的bFGF的轉(zhuǎn)錄,免疫組化檢測(cè)蛋白水平bFGF的表達(dá)和VEGF的表達(dá),半定量PCR觀測(cè)bFGF與VEGF,LMP-1及BGP的轉(zhuǎn)錄水平關(guān)系.結(jié)果:成功構(gòu)建pIRES2-EGFP-bFGF,電穿孔儀有效地將質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)入MSCs和OB,熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光蛋白(green fluorescence protein,GFP)表達(dá),流式細(xì)胞儀觀測(cè),MSCs電穿孔轉(zhuǎn)染效率達(dá)到14.9%,OB的轉(zhuǎn)染效率2

3、7%;免疫組織化學(xué)檢測(cè)和RT-PCR檢測(cè)成功檢測(cè)到bFGF的轉(zhuǎn)錄和表達(dá),半定量PCR發(fā)現(xiàn),bFGF的表達(dá)與VEGF的表達(dá)呈相關(guān)性,與BGP,LMP-1表達(dá)無關(guān).結(jié)論:bFGF基因轉(zhuǎn)染MSCs,可以有效的上調(diào)VEGF的表達(dá),bFGF與VEGF得以聯(lián)合發(fā)揮作用,促進(jìn)了內(nèi)皮細(xì)胞的增殖,但是,bFGF對(duì)成骨細(xì)胞及MSCs中LMP-1、BGP(骨鈣素)的表達(dá)沒有影響,不能促進(jìn)成骨細(xì)胞及MSCs向成骨方向分化,因此,在未來的MSCs轉(zhuǎn)基因治療中,同