過(guò)表達(dá)CREG的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療大鼠心肌梗死的作用及機(jī)制研究.pdf

1、實(shí)驗(yàn)背景：
　　心肌梗死(myocardial infarction，MI)是常見(jiàn)的致死性疾病之一，即使患者度過(guò)急性期，也可能會(huì)由于成體心肌細(xì)胞的再生能力不足，使心肌細(xì)胞發(fā)生不可逆的丟失，進(jìn)一步壞死心肌組織會(huì)被纖維瘢痕組織替代，最終導(dǎo)致心力衰竭的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)移植技術(shù)治療MI能夠有效防止病理性心室重構(gòu)，增強(qiáng)心臟收縮功能，促進(jìn)心功能恢復(fù)。BM

2、SCs移植到梗死心肌邊緣區(qū)后，可通過(guò)旁分泌多種生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)血管新生，從而改善梗死區(qū)微環(huán)境進(jìn)而發(fā)揮功效。因此，通過(guò)人工干預(yù)手段提高BMSCs移植后的促血管新生因子旁分泌的作用，始終是心血管病學(xué)、組織工程學(xué)和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。E1A激活基因阻遏子(cellular repressor of E1A-stimulated genes，CREG)在成體組織細(xì)胞中廣泛表達(dá)，但是在原始干細(xì)胞中幾乎不表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，在血管內(nèi)皮細(xì)胞中，CREG可

3、促進(jìn)其分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)；而在胚胎干細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)CREG可促進(jìn)其向內(nèi)皮細(xì)胞定向分化并形成新生血管。我們的前期體外研究也發(fā)現(xiàn)，BMSCs過(guò)表達(dá)CREG后，能夠在體外對(duì)抗病理?xiàng)l件導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。但是，在體情況下，CREG基因修飾的BMSCs對(duì)急性MI的治療作用及機(jī)制均不清楚。因此，本研究擬通過(guò)動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)闡明過(guò)表達(dá)CREG后BMSCs治療MI的效果并探討其

4、機(jī)制，為防治心肌梗死提供新的治療手段和理論依據(jù)。
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?br>　　1.明確過(guò)表達(dá)CREG的BMSCs移植對(duì)大鼠心肌梗死的治療作用；
　　2.明確過(guò)表達(dá)CREG的BMSCs移植是否通過(guò)促進(jìn)旁分泌及血管新生發(fā)揮減輕MI損傷的作用；
　　3.明確CREG是否通過(guò)上調(diào)HIF-1α促進(jìn)BMSCs的旁分泌作用。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　1.過(guò)表達(dá)CREG的BMSCs建立：利用表達(dá)CREG-GFP和GFP的腺病毒分

5、別感染BMSCs，建立CREG過(guò)表達(dá)的BMSCs(CREGBMSCs)和感染對(duì)照組BMSCs(GFPBMSCs)。通過(guò)熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效果，當(dāng)轉(zhuǎn)染效率達(dá)95％以上后，可用于進(jìn)行干細(xì)胞移植。2.大鼠MI模型的制備：利用2%異氟烷揮發(fā)性麻藥麻醉大鼠并固定于操作臺(tái)上，經(jīng)其左側(cè)胸骨的第4、5肋間將心臟暴露，通過(guò)結(jié)扎大鼠的心臟冠脈左前降支(left anterior desending coronary artery，LAD)建立MI模型；然后

6、在梗死心臟邊緣區(qū)域進(jìn)行5個(gè)點(diǎn)注射治療。根據(jù)注射成分的不同將大鼠分為4組，分別是注射對(duì)照組(PBS組)，普通BMSCs(NormBMSCs)治療組，GFPBMSCs治療組和CREGBMSCs治療組。
　　3.干細(xì)胞移植治療MI后的第3天與14天，
　　(1)利用小動(dòng)物超聲測(cè)定大鼠心功能；
　　(2)采用Masson染色檢測(cè)小鼠心肌纖維化程度；
　　(3)利用Western blots方法檢測(cè)心肌組織中凋亡指標(biāo)cle

7、aved Caspase-3表達(dá)水平；
　　(4)利用ELISA方法檢測(cè)心肌組織中VEGF的表達(dá)水平；
　　(5)通過(guò)共聚焦顯微鏡觀察心肌組織中CD31的表達(dá)水平；
　　4.體外模擬缺氧環(huán)境，通過(guò)ELISA方法檢測(cè)過(guò)表達(dá)CREG對(duì)BMSCs的旁分泌生長(zhǎng)因子影響，同時(shí)采用Matrigel方法觀察其對(duì)血管新生的影響。
　　5.通過(guò)Western blot方法以及Real-time PCR方法來(lái)，探討體外缺氧條件下CR

8、EG調(diào)控BMSCs旁分泌的分子機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1.體內(nèi)部分
　　(1)過(guò)表達(dá)CREG的BMSCs治療組(CREGBMSCs)的大鼠第3天與第14天的射血分?jǐn)?shù)(ejection fraction，EF)和短軸縮短率(fractional shortening，F(xiàn)S)比PBS組、NormBMSCs治療組以及 GFPBMSCs治療組均有明顯的改善。這一結(jié)果表明，CREG過(guò)表達(dá)可提高BMSCs移植治療MI的效果，使

9、心功能得到進(jìn)一步的改善。
　　(2) CREGBMSCs治療組的大鼠心臟纖維化面積明顯少于PBS組、NormBMSCs治療組和GFPBMSCs治療組。這一結(jié)果表明，CREG過(guò)表達(dá)的BMSCs移植治療可進(jìn)一步減少心肌纖維化的發(fā)生，從而延緩心室重構(gòu)。
　　(3)無(wú)論在3天還是14天時(shí)間點(diǎn)，CREGBMSCs治療組的大鼠心肌凋亡指標(biāo)cleaved Caspase-3表達(dá)水平明顯低于其他3組。這一結(jié)果表明，CREG過(guò)表達(dá)BMSCs移

10、植治療可以進(jìn)一步減少心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生。
　　(4)無(wú)論在3天還是14天時(shí)間點(diǎn)，CREGBMSCs治療組的大鼠心臟的血管新生都明顯多于其他3組。這一結(jié)果表明，CREG過(guò)表達(dá)BMSCs移植治療可進(jìn)一步促進(jìn)血管新生，從而改善梗死區(qū)微環(huán)境。
　　(5)過(guò)表達(dá)CREG能夠延緩移植后BMSCs的凋亡，同時(shí)延長(zhǎng)VEGF的旁分泌作用。2.體外部分
　　(1)體外缺氧條件下，CREG過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)BMSCs分泌VEGF；培養(yǎng) CREG

11、BMSCs的上清液可以促進(jìn)體外內(nèi)皮細(xì)胞血管網(wǎng)的形成。
　　(2) CREG促進(jìn)HIF-1α的表達(dá)以及核轉(zhuǎn)位。
　　(3)通過(guò)HIF-1α的siRNA抑制實(shí)驗(yàn)證實(shí)，CREG通過(guò)調(diào)控HIF-1α促進(jìn)VEGF分泌，進(jìn)而促進(jìn)血管新生。
　　(4)過(guò)表達(dá)CREG降低VHL（降解HIF-1α的主要分子）mRNA合成，繼而上調(diào)HIF-1α。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論：
　　1.過(guò)表達(dá)CREG的 BMSCs移植治療能夠進(jìn)一步提高BMS