旁分泌機(jī)制在脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療心肌梗死中的作用.pdf

1、心血管疾病是目前人類死亡的主要原因之一,目前我國人群心血管病的患病率處于持續(xù)上升階段[1]。心肌僅有有限的自我再生能力[2],目前的藥物或介入等臨床治療方法只能延緩心力衰竭的發(fā)展[3]。干細(xì)胞移植已成為治療心肌梗死的新策略[4]。近年來的研究證明干細(xì)胞治療可以顯著改善心室重構(gòu)和提高心功能(包括左室收縮功能、舒張功能和冠脈血流儲備等)[5,6]。干細(xì)胞對心肌梗死(myocardialinfarction,MI)的治療作用主要包括兩個(gè)機(jī)制,

2、即直接分化和旁分泌作用。一些研究提示間充質(zhì)干細(xì)胞可以在體外誘導(dǎo)環(huán)境下和在體移植后分化為心肌細(xì)胞和血管細(xì)胞,實(shí)現(xiàn)一定程度上的心肌再生。但另一些研究認(rèn)為間充質(zhì)干細(xì)胞不能分化為心肌細(xì)胞和血管細(xì)胞,其治療功能完全是旁分泌作用[7,8]——通過釋放旁分泌因子到周圍組織,發(fā)揮保護(hù)作用。但是,直接分化和旁分泌作用在干細(xì)胞對心肌梗死治療中的具體機(jī)制及其各自所貢獻(xiàn)比重尚不清楚[9,10]。
　　脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(Adipose-derivedMes

3、enchymalStemCells,ADSC)因易大量獲取、較強(qiáng)增殖能力和多向分化潛能,加之免疫原性低的優(yōu)勢,被認(rèn)為是治療心臟病的理想干細(xì)胞來源;且新鮮分離的人ADSC的數(shù)量足以達(dá)到臨床治療的細(xì)胞數(shù)量,故不需在體外擴(kuò)增即可用于自體移植,臨床意義重大[11]。ADSC對心肌梗死的治療作用明顯優(yōu)于骨髓來源的干細(xì)胞[8]。直接分化和旁分泌作用在ADSC治療心肌梗死中的作用機(jī)制未見報(bào)道。最近的研究發(fā)現(xiàn)ADSC條件培養(yǎng)液(conditionedm

4、edium,CM)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的存活和遷移而影響血管新生[14]。但這些研究均局限于細(xì)胞實(shí)驗(yàn),ADSC-CM與ADSC是否對心肌梗死具有同等的治療作用尚不清楚。ADSC-CM能否在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中保護(hù)心肌組織和促進(jìn)血管新生亦未見報(bào)道。本研究比較了ADSC-CM與ADSC對小鼠心肌梗死的治療效果,評估了旁分泌機(jī)制在ADSC治療中的作用,探討了ADSC的旁分泌抗心肌細(xì)胞凋亡作用及其機(jī)制,并比較了移植后ADSC的直接分化和旁分泌作用在心肌梗死治療作

5、用中的貢獻(xiàn)比重。
　　方法:
　　原代分離和培養(yǎng)人ADSC,將經(jīng)鑒定的第3~5代的ADSC用于實(shí)驗(yàn)。
　　1.用8~10周齡(20~24g)的雄性C57B/L小鼠,結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支建立心肌梗死(myocardialinfarction,MI)損傷模型,實(shí)驗(yàn)分假手術(shù)組,MI+DMEM組、MI+ADSC-CM組和MI+ADSC組(N=12)。在MI處理的小鼠心肌梗死邊緣區(qū)分別注射DMEM、ADSC-CM或者ADSC,通

6、過觀察動(dòng)物生存率、TTC染色測量心肌梗死面積、超聲評價(jià)心功能變化、TUNEL染色檢測心肌細(xì)胞凋亡等,評價(jià)各種處理對心肌梗死的治療效果。
　　2.用H2O2建立大鼠乳鼠心肌細(xì)胞(neonatalratventricularmyocytes,NRVM)體外損傷模型,觀察ADSC-CM對心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)分DMEM組,H2O2+DMEM組和H2O2+ADSC-CM組(N=5)。用caspase-3蛋白表達(dá)定量和TUNEL染色檢測心

7、肌細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)果:
　　1.DMEM組存活率為66.7％,ADSC-CM組存活率為70.0%,ADSC組存活率為72.7%。三個(gè)組生存率無組間統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),提示ADSC-CM或者ADSC心肌內(nèi)注射不能提高M(jìn)I小鼠的存活率。
　　2.與DMEM組相比,ADSC和ADSC-CM心肌內(nèi)注射均能減少梗死面積,但ADSC組和ADSC-CM組間無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(DMEM:41.9±3.0%;ADSC:32.2±

8、2.8%;ADSC-CM:35.7±2.5%)。
　　3.術(shù)后4周超聲結(jié)果顯示,假手術(shù)組小鼠心功能前后無明顯變化,DMEM組小鼠心梗后(EF:43.8±3.7%,FS:19.0±3.8%)較假手術(shù)組(EF:90.8±5.4%,FS:45.6±6.8%)明顯降低。心肌內(nèi)注射ADSC-CM(EF:60.4±5.8%,FS:27.6±3.5%)較DMEM明顯提高心功能。ADSC組(EF:69.2±4.3%;FS:34.3±2.5%)較A

9、DSC-CM組進(jìn)一步提高心功能。
　　4.MI手術(shù)后4周的梗死邊緣區(qū)的血管新生。ADSC組和ADSC-CM組的毛細(xì)血管密度明顯高于DMEM組。但ADSC組和ADSC-CM組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　5.在心肌細(xì)胞損傷模型中,H2O2誘導(dǎo)組caspase-3蛋白表達(dá)較DMEM組明顯升高,ADSC-CM預(yù)處理可明顯降低caspase-3的表達(dá)。同時(shí)TUNEL染色亦顯示:ADSC-CM預(yù)處理可明顯減少NRVM的TUNEL陽性率。

10、>　　6.TUNEL染色檢測MI后2天梗死邊緣區(qū)的心肌細(xì)胞凋亡。ADSC-CM組和ADSC組的心肌細(xì)胞TUNEL陽性率較DMEM組明顯減少,而ADSC-CM組和ADSC組間相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　7.MI后4周,可以檢測到移植存活的ADSC。ADSC不表達(dá)心肌細(xì)胞標(biāo)志物Tropomyosin和a-actinin;部分ADSC可表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物vWF和平滑肌細(xì)胞標(biāo)志物SMA。
　　8.MI后4周,ADSC-CM或ADSC均促

11、進(jìn)梗死邊緣血管新生。ADSC組血管新生密度較DMEM組增加64.3%。CD31+和GFP+雙陽性的細(xì)胞(ADSC直接分化的血管細(xì)胞)占新生血管總量的3.4±0.7%。直接分化在ADSC對心肌梗死治療作用的貢獻(xiàn)很小(小于10%),而旁分泌機(jī)制起主導(dǎo)作用(大于90%)。
　　結(jié)論:
　　ADSC-CM心肌內(nèi)注射可減小心梗面積和改善心功能,起到與ADSC移植類似的治療效果。ADSC在心肌內(nèi)可分化為血管細(xì)胞參與血管新生,但直接分化對