骨髓間充質干細胞和苯妥英鈉中介的旁分泌機制在心肌梗死后組織修復中的作用.pdf

1、背景：心肌梗死(MI)后心肌細胞的喪失和病理性心室重塑是進展為心功能不全的主要成因。以干細胞為基礎的心臟修復為重建受損心肌帶來希望?；A實驗及臨床研究在證實細胞移植安全可行的基礎上，顯示其介導的組織修復很大程度上受益于強大的旁分泌作用，即促進血管形成、抑制細胞凋亡、激活內源性修復機制。苯妥英鈉(PHT)具有促進結締組織增生的藥理特性，研究證實PHT可誘導表皮成纖維細胞多種生長因子及其受體表達上調，增強生長因子的自分泌或旁分泌活性，即PH

2、T中介的旁分泌作用。最近，有報道PHT可靶向性地促進MI大鼠梗死區(qū)的膠原沉積與成熟，加速梗死區(qū)的基質修復，但具體機制尚不十分清楚。 目的：建立大鼠心肌60分鐘缺血再灌注(I/R)模型，給與同種異體骨髓間充質干細胞(MSCs)心肌內注射、PHT腹腔內注射或者二者的聯(lián)合應用，觀察MI 后血管形成和左室重塑的變化，評價心功能，并檢測梗死區(qū)血管內皮生長因子 (VEGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、基質金屬蛋白酶-2(MMP-2

3、)、組織型基質金屬蛋白酶抑制劑-1(TIMP-1)的蛋白表達水平，在證實MSCs和PHT 改善MI后組織修復的基礎上，探索二者聯(lián)合應用的綜合效應，分析MSCs和PHT介導的旁分泌機制在心肌修復中的可協(xié)同性。 方法：56只建模成功并存活的雄性Wistar 大鼠隨機分為5組：假手術組(12只)、對照組(12只)、PHT組(12只)、MSCs組(11只)以及MSCs+PHT組(9只)。采用全血貼壁法培養(yǎng)的3-4代MSCs在移植前用熒光

4、染料DAPI標記，于建模恢復再灌注之時按照1×10<'6>/100μL/只的劑量注射至梗死周邊區(qū)域。對照組和PHT組注射細胞培養(yǎng)基。PHT組和MSCs+PHT組在建模后，連續(xù)14天給與腹腔內注射 PHT 75mg/kg/day。術后第7天，各組分別處死 6、6、6、5、5只，留取心臟標本，通過苦味酸-天狼猩紅染色測定梗死范圍、膠原容積分數(shù)(CVF)等，結合偏振光顯微鏡分析梗死區(qū)膠原成熟程度，麥胚凝集素 (WGA) 熒光染色測定室間隔心肌

5、細胞橫截面積(CSA)；vWF和α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)免疫熒光染色分別計算梗死區(qū)及其邊緣的毛細血管和小動脈密度；Western blot檢測梗死區(qū)VEGF、bFGF、MMP-2 和 TIMP-1 的蛋白表達水平。術后第28天，各組剩余動物進行有創(chuàng)血流動力學檢查，測定主動脈收縮壓(SBP) 和舒張壓(DBP)、左室舒張末壓(LVEDP)、左室內壓最大上升速率和最大下降速率(+dp/dt<,max>及-dp/dt)。隨后

6、處死并留取心臟標本，進行病理學分析，所測指標與術后第7天相同。 結果：1.細胞實驗相關結果：1)體外培養(yǎng)的大鼠MSCs呈貼壁生長，形態(tài)多樣，以梭形多見。原代MSCs生長緩慢，一代以后細胞增殖迅速。2)第3、4代MSCs經(jīng)DAPI標記后，細胞核著色，紫外光激發(fā)呈現(xiàn)藍色，細胞核多為圓形或卵圓形。3)MSCs移植至梗死邊緣區(qū)后，術后第7天、第28天的心臟組織切片顯示，存活的MSCs主要分布于梗死區(qū)邊緣和梗死區(qū)內。部分DAPI標記的MS

7、Cs表達vWF或α-SMA，提示MSCs分化為內皮細胞或平滑肌細胞，參與毛細血管、小動脈的發(fā)生。 2.動物實驗結果：1)病理學大體指標：①梗死范圍：術后第7天，各組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；術后第28天，和對照組(41.80±5.21％)比較，PHT組、MSCs組和MSCs±PHT組梗死范圍減小，而且MSCs組和MSCs+PHT組梗死范圍小于PHT組(P<0.05)；②梗死區(qū)室壁厚度：術后第7天，和對照組比較，MSCs組和

8、Mscs+PHT組室壁厚度增大；術后第28天，和對照組(1.44±0.30mm)比較，PHT組、MSCs組和MSCs+PHT組室壁厚度增大，而且MSCs組和MSCs+PHT組室壁厚度大于PHT組；③膨展指數(shù)：術后第7、28天，和對照組比較，PHT組、MSCs組和MSCs+PHT組膨展指數(shù)均減?。欢倚g后第28天，MSCs組和MSCs+PHT組膨展指數(shù)小于PHT組；④室間隔心肌細胞CSA：術后第7、28天，和對照組比較，PHT組、MSCs

9、組和MSCs+PHT組CSA均減?。?)膠原分析：①梗死區(qū)CVF：術后第7天，各組間比較差異無統(tǒng)計學意義；術后第28天，和對照組比較，PHT組、MSCs組和MSCs+PHT組CVF均減小；②梗死區(qū)膠原成熟程度：術后第7天，各組間比較無差異；術后第28天，和對照組或PHT組比較，MSCs組和MSCs+PHT組膠原成熟度均減小(P<0．01)；和術后第7天比較，對照組和PHT組術后第28天膠原成熟度均增大(P<0．01)；③室間隔CVF：術

10、后第28天，和對照組比較，PHT組、MSCs組和MSCs+PHT組CVF均減小(P<0．01)；3)免疫熒光染色結果：①毛細血管密度(vWF染色)：術后第7天，和對照組(84．00±16．73/mm<'2>)比較，MSCs組和MSCs+PHT組毛細血管密度增大；而且MSCs+PHT組毛細血管密度高于PHT組(160．00±34．14/mm<'2> vs．110．00±23．66/mm<'2>，P<0．05)；術后第28天，和假手術組或對

11、照組比較，PHT組、MSCs組和MSCs+PHT組毛細血管密度均增大；而且MSCs+PHT組毛細血管密度高于PHT組(100．00±19．15/mm<'2>vs．71．00±16．02/mm<,2>，P<0．05)；②小動脈密度(α-SMA染色)：術后第7天，和對照組(10．16±3．35/mm<'2>)或PHT組比較，MSCs組和MSCs+PHT組小動脈密度均增大；術后第28天，和對照組(12．96±4．33/mm<'2>)比較，PH

12、T組、MSCs組以及MSCs+PHT組小動脈密度均增大； 4)Western blot 檢測結果：①VEGF和bFGF：假手術組左室游離壁幾乎沒有VEGF或bFGF蛋白的表達，余4組間的差異無統(tǒng)計學意義；bFGF蛋白水平測定有依次升高趨勢，以MSCs組和MsCs+PHT組為著；②MMP-2：和假手術組比較，余4組MMP-2蛋白表達水平顯著升高；4組間比較，蛋白表達水平無差異；③TIMP-1：PHT組TIMP-1蛋白表達水平低于其他各組，

13、剩余組間差異無顯著性；5)血流動力學檢測結果：3個處理組和對照組比較，SBP、DBP、LVEDP、+dp/dt<,max>以及-dp/dt<,max>的差異均無統(tǒng)計學意義。 結論：1)MSCs移植主要通過旁分泌機制介導加速心肌修復、促進血管形成、改善心室重塑的作用，但細胞移植顯著抑制梗死區(qū)的膠原成熟；2)PHT亦可通過旁分泌機制介導加速心肌修復、促進血管新生、改善心室重塑的作用，但效果不如MSCs移植顯著；3)PHT依賴旁分泌作