心臟細(xì)胞旁分泌作用誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為心肌樣細(xì)胞的相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、目的:體外模擬心肌微環(huán)境，探討心臟細(xì)胞旁分泌作用誘導(dǎo)BM-MSCs向心肌細(xì)胞分化的相關(guān)機(jī)制。
　　 方法:分離培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞、心臟成纖維細(xì)胞、BM-MSCs。
　　 將大鼠BM-MSCs分別與心肌細(xì)胞、心臟成纖維細(xì)胞建立共培養(yǎng)體系，RT-PCR方法檢測BM-MSCs心肌特異性轉(zhuǎn)錄因子和結(jié)構(gòu)蛋白的核酸表達(dá)，分析心肌細(xì)胞、心臟成纖維細(xì)胞對BM-MSCs向心肌細(xì)胞分化的誘導(dǎo)作用。
　　 根據(jù)不同誘導(dǎo)方法，將培養(yǎng)BM-

2、MSCs分為四組，A：陰性對照組；B：單純Wnt11誘導(dǎo)組；C：心肌細(xì)胞誘導(dǎo)組；D：心肌細(xì)胞+Wnt11誘導(dǎo)組。各組細(xì)胞均共培養(yǎng)14天，應(yīng)用RT-PCR或Western blot方法檢測BM-MSCs各信號通路（Wnt,BMP,Notch,FGF,Hedgehog）關(guān)鍵信號分子的表達(dá)，分析心肌細(xì)胞旁分泌作用誘導(dǎo)BM-MSCs向心肌細(xì)胞分化的相關(guān)信號通路的作用機(jī)制。
　　 在共培養(yǎng)體系中，加入BMP信號通路的抑制劑Noggin，R

3、T-PCR方法檢測BM-MSCs心肌特異性轉(zhuǎn)錄因子和結(jié)構(gòu)蛋白的核酸表達(dá)，分析BMP信號通路在心肌細(xì)胞旁分泌作用誘導(dǎo)BM-MSCs向心肌細(xì)胞分化過程中的作用。
　　 結(jié)果:
　　 1. 細(xì)胞培養(yǎng)成功建立了心肌細(xì)胞、心臟成纖維細(xì)胞的分離、純化、鑒定、擴(kuò)增及與BM-MSCs共培養(yǎng)的方法體系。
　　 2. 心肌細(xì)胞、心臟成纖維細(xì)胞對BM-MSCs向心肌細(xì)胞分化的誘導(dǎo)作用與陰性對照組比較，心肌細(xì)胞誘導(dǎo)組Nkx-2.5、α-

4、MHC、β-MHC、cTnI表達(dá)顯著增強(qiáng)；與陰性對照組相比，成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)組Nkx-2.5、α-MHC、β-MHC、cTnI的表達(dá)變化不明顯，其差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3. BM-MSCs向心肌細(xì)胞分化時(shí)，相關(guān)信號通路關(guān)鍵信號分子表達(dá)變化RT-PCR檢測結(jié)果顯示，與陰性對照組比較，心肌細(xì)胞誘導(dǎo)組和心肌細(xì)胞+Wnt11誘導(dǎo)組Wnt經(jīng)典通路、BMP、Notch和Hedgehog信號通路關(guān)鍵信號分子的表達(dá)明顯升高；與單純Wnt11誘

5、導(dǎo)組比較，心肌細(xì)胞誘導(dǎo)組和心肌細(xì)胞+Wnt11誘導(dǎo)組Wnt經(jīng)典通路、BMP、Notch、Hedgehog信號通路關(guān)鍵信號分子的表達(dá)升高；各組中FGF信號通路Frs2表達(dá)變化不明顯，各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 Western blot結(jié)果顯示，與陰性對照組比較，單純Wnt11誘導(dǎo)組、心肌細(xì)胞誘導(dǎo)組和心肌細(xì)胞+Wnt11誘導(dǎo)組Wnt非經(jīng)典通路中p-JNK的表達(dá)增強(qiáng)；與單純Wnt11誘導(dǎo)組比較，心肌細(xì)胞誘導(dǎo)組和心肌細(xì)胞+Wnt11

6、誘導(dǎo)組p-JNK的表達(dá)較低。
　　 4. BMP信號通路對BM-MSCs向心肌細(xì)胞分化的影響共培養(yǎng)體系中加入BMP信號通路的抑制劑Noggin，RT-PCR結(jié)果顯示，與未加抑制劑組相比較，BM-MSCs中Nkx-2.5、GATA4、α-MHC、β-MHC、cTnI、ANP、Mef2c的表達(dá)均明顯降低。
　　 結(jié)論:
　　 1.心肌細(xì)胞旁分泌作用可誘導(dǎo)BM-MSCs向心肌細(xì)胞分化，心臟成纖維細(xì)胞無此作用。