電磁場對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞體外誘導分化為心肌樣細胞影響的研究.pdf

1、目的:各種病因造成心肌組織不可逆損傷均可導致心肌細胞數(shù)量的減少、心肌丟失。成年心肌再生能力差，壞死心肌無法通過自身的增殖、分化進行修復，丟失的心肌被瘢痕組織替代，造成心臟重構(gòu)、心功能下降，最終導致慢性心力衰竭的發(fā)生。成體心肌細胞的再生是醫(yī)學界急待解決的難題之一。骨髓間充質(zhì)干細胞(mensenchymalstemcell，MSCs)所具有的多能分化特性為心肌細胞再生的研究提供了新的方向和思路。骨髓中MSCs的含量非常少，必需在體外分離純化

2、、培養(yǎng)擴增才能滿足要求，而如何獲得大量純化的MSCs則成為臨床利用這些細胞治療疾病的前提。1999年Makino等首次體外給予3μmol/L的5-氮胞苷(5-Azacytidine，5-aza)誘導MSCs定向分化心肌樣細胞獲得成功，開創(chuàng)了MSCs體外誘導分化心肌樣細胞研究的先河。但仍然存在著誘導出功能性心肌樣細胞的重復性差、誘導比率低、誘導條件不成熟等問題。已有研究證實，脈沖電磁場(pulsedelectromagneticfield

3、s，PEMFs)可以促進MSCs向成骨方向分化。但其對MSCs向心肌樣細胞分化有無影響尚不清楚。因此本研究擬在用5-aza體外誘導MSCs分化為心肌樣細胞的基礎(chǔ)上，探討電磁場對MSCs的增殖及向心肌樣細胞分化的影響。 方法1.通過對比不同鼠齡、不同純化方法對大鼠MSCs集落形成和生長特性的影響，篩選大鼠MSCs分離、培養(yǎng)的條件，選取CD44、CD105細胞免疫組化方法對大鼠MSCs進行初步鑒定。 2.取第三代大鼠MSCs

4、隨機分A、B、C為三組，分別加入5μmol/L、10μmol/L和20μmol/L的5-aza；每組分別孵育12h、24h和48h，繼續(xù)培養(yǎng)28d。相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化以及電境觀察誘導前后超微結(jié)構(gòu)變化，細胞免疫化學染色檢測α-肌動蛋白(α-actin)和心肌肌鈣蛋白T(cardiactroponinT，cTnT)表達，并通過Western印跡法對細胞cTnT進行半定量分析。 3.50Hz的PEMFs干預5-aza誘導7d后

5、的大鼠MSCs，0.5mT、1mT和5mT三種感應強度分別為A、B、C三組，各組根據(jù)暴露時間10min/d、20min/d、30min/d及60min/d又分1、2、3、4亞組，作用4d后采用MTT法測定細胞增殖變化，作用14d后流式檢測細胞周期和Western印跡法檢測cTnT的表達，了解PEMFs對體外誘導的大鼠MSCs增殖和分化的影響。 結(jié)果1.2月齡大鼠比6月齡大鼠操作方便、集落形成率高、增殖性強。全骨髓貼壁篩選組原代培

6、養(yǎng)5d大鼠MSCs形成集落數(shù)顯著多于Percoll密度離心組；細胞組分比Percoll密度離心組復雜，但P3代以后兩者細胞組分基本一致，CD44、CD105細胞免疫化學染色檢測，兩組陽性率均為90％左右。 2.5-aza誘導28d大鼠MSCs的α-actin、cTnT免疫化學染色陽性；透射電鏡觀察可見誘導后大鼠MSCs細胞內(nèi)有肌絲樣結(jié)構(gòu)形成；Western印跡顯示誘導后的大鼠MSCs表達心肌特異性結(jié)構(gòu)蛋白cTnT，5μmol/L

7、的5-aza孵育48h、10μmol/L孵育24h與10μmol/L的5-aza孵育48h、20μmol/L三個孵育時間組大鼠MSCs的cTnT表達量高于其余各組，但后者的細胞生物學特性受到明顯影響。 3.50Hz的PEMFs分組作用于5-aza誘導后的大鼠MSCs，0.5mT和1mT感應強度下暴露20min～30min/d顯著性促進大鼠MSCs增殖，5mT暴露30min/d和60min/d以及1mT暴露60min/d顯著性抑制

8、大鼠MSCs增殖。各感應強度下暴露60min/d以及5mT感應強度下暴露20min/d以上均引起大鼠MSCs細胞周期S+G2％的下降，0.5mT和1mT暴露20min～30min/d內(nèi)引起大鼠MSCs細胞周期S+G2％增高。 4.Western印跡檢測cTnT的表達量結(jié)果顯示0.5mT暴露60min/d內(nèi)、1mT暴露20min/d和30min/d、5mT暴露20min/d和30min/d的cTnT表達量較對照組均增加；僅5mT暴

9、露10min/d的cTnT的表達量減少；其余cTnT的表達量變化不明顯。 結(jié)論1.大鼠MSCs在體外經(jīng)5-aza誘導后可分化為心肌樣細胞；5μmol/L的5-aza孵育48h和10μmol/L的5-aza孵育24h是大鼠MSCs體外誘導分化心肌樣細胞的理想條件。 2.PEMFs可以促進大鼠MSCs增殖，在50Hz、0.5mT和1mT感應強度下暴露20min～30min/d條件下作用顯著。 3.PEMFs能促進大鼠