骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為胰島樣細(xì)胞及治療糖尿病大鼠的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：將大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Marrow-derived Mesenchymal Stemcells，BM-MSCs)在體外誘導(dǎo)分化為胰島樣細(xì)胞，并觀察其對(duì)糖尿病大鼠模型的治療作用。
　　方法：1.大鼠BM-MSCs的誘導(dǎo)分化：取2周齡大鼠骨髓，純化、擴(kuò)增得到BM-MSCs，取P3代BM-MSCs應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD29、CD90、CD44和CD34，然后用堿性成纖維細(xì)胞生長因子(Basic fibroblast g

2、rowth factors，bFGF)、肝細(xì)胞生長因子(Hepatocyte growth factor，HGF)等誘導(dǎo)6天，用β細(xì)胞調(diào)節(jié)素(Betaeellulin，BTC)、尼克酰胺等誘導(dǎo)12天，應(yīng)用免疫細(xì)胞染色，雙硫腙染色(Dithizone，DTZ)，RT-PCR等檢測(cè)誘導(dǎo)情況。并用insulin1(胰島素1)特異性RNA下擾誘導(dǎo)后細(xì)胞。
　　2.大鼠糖尿病模型的移植治療：健康雄性SD大鼠，腹腔注射鏈脲佐菌素(Strept

3、ozotocin，STZ)建立糖尿病模型，建模成功后，隨機(jī)分為三組：①對(duì)照組；②移植誘導(dǎo)的胰島樣細(xì)胞組；③移植RNA干擾后的胰島樣細(xì)胞組；兩實(shí)驗(yàn)組經(jīng)腎包囊移植Brdu標(biāo)記的胰島樣細(xì)胞，對(duì)照組則經(jīng)腎包囊移植相同體積生理鹽水。觀察移植后7、14、21、28d各組糖尿病大鼠血糖變化。28d后處死大鼠取腎臟做免疫組織化學(xué)檢查。
　　結(jié)果：1.成功將大鼠BM-MSCs純化、擴(kuò)增，BM-MSCs體外經(jīng)HGF、bFGF等因子誘導(dǎo)后，細(xì)胞呈團(tuán)簇狀

4、，雙硫腙染成紅棕色，免疫細(xì)胞染色顯示胰島素呈陽性表達(dá)，透射電鏡顯爾其有分泌細(xì)胞特點(diǎn)，RT-PCR示insulin1、胰腺十二指腸同源框-1(Pancreatic duodenal homeobox-1，PDX-1)及葡萄糖激酶(Glucokinase，GK)基因表達(dá)陽性(P<0.05)，RNA特異性干擾后insulin1基因表達(dá)陰性，胰島素蛋白分泌陰性，表明大鼠BM-MSCs可以向胰島樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化。
　　2.大鼠腹腔注射STZ后，成

5、功建立糖尿病模型，細(xì)胞移植后，對(duì)照組和移植干擾細(xì)胞組大鼠血糖無明顯好轉(zhuǎn)(P>0.05)，移植誘導(dǎo)細(xì)胞組大鼠血糖與其余兩組和移植前相比較，明顯降低(P<0.05)。Brdu免疫組織化學(xué)染色顯示：在腎臟小管上皮可見散在分布的Brdu陽性細(xì)胞，胰島素呈陽性表達(dá)。
　　結(jié)論：1.經(jīng)全骨髓貼壁培養(yǎng)法可獲得較純化BM-MSCs，強(qiáng)表達(dá)CD29、CD90、CD44，而CD34微表達(dá)；
　　2.大鼠BM-MSCs經(jīng)含bFGF、HGF、BTC