大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞體外誘導(dǎo)為胰島樣細胞及對糖尿病大鼠模型治療的臨床觀察.pdf

1、目的：對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)進行分離培養(yǎng)、體外擴增，采用含不同葡萄糖濃度的培養(yǎng)基加尼克酰胺、Exendin-4進行誘導(dǎo)。采用免疫細胞化學(xué)染色、雙硫腙染色、電鏡、放射免疫分析等方法對BMSCs誘導(dǎo)分化的胰島樣細胞進行鑒定，并觀測不同葡萄糖濃度及誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)效果的差異。將誘導(dǎo)后的細胞通過尾靜脈及腎包囊移植入糖尿病大鼠模型體內(nèi)，通過對血糖的檢測，觀察胰島樣細胞對糖尿病大鼠模型的治療效果。 方法： 1.取3～4周齡的

2、雄性SD大鼠，采用percoll密度梯度離心法結(jié)合貼壁培養(yǎng)法分離純化BMSCs，傳代擴增，倒置相差顯微鏡下進行形態(tài)學(xué)觀察。取純化度較高的第3代細胞進行誘導(dǎo)分化，按實驗設(shè)計分為6組：①低糖對照組；②中糖對照組；③高糖對照組；④低糖誘導(dǎo)組；⑤中糖誘導(dǎo)組；⑥高糖誘導(dǎo)組。 2.誘導(dǎo)后進行細胞鑒定：倒置相差顯微鏡下觀測細胞形態(tài)學(xué)變化；透射電鏡觀察細胞超微結(jié)構(gòu)的改變；雙硫腙染色法、免疫細胞化學(xué)染色法對胰島樣細胞進行鑒定。用放射免疫分析法觀察

3、誘導(dǎo)后細胞對葡萄糖刺激試驗的反應(yīng)。Realtime-PCR檢測誘導(dǎo)組及對照組細胞胰島β細胞相關(guān)基因的表達。 3.將24只雌雄各半的SD大鼠通過腹腔注射鏈脲佐菌素破壞胰腺造成糖尿病大鼠模型，分為：①腎包囊對照組：②腎包囊組；③尾靜脈對照組；④尾靜脈組。將Brdu標記的細胞從大鼠腎包囊或尾靜脈移植入糖尿病大鼠模型體內(nèi)，觀察臨床療效，免疫組織化學(xué)染色確定Brdu標記的細胞及胰島素在心、肝、肺、脾、胃、腎以及胰腺的分布。 結(jié)果：

4、 1.BMSCs接種初期可見大量懸浮細胞，24小時后觀察大部分細胞開始貼壁生長。貼壁生長的細胞呈單個分散存在或形成數(shù)個細胞克隆，逐漸伸角變形，呈圓形、多角形、長梭形等多種形態(tài)。傳至3代，細胞純化，形態(tài)較為單一，呈長梭形貼壁生長，以平行排列生長為主或呈漩渦狀生長。 2.分低糖、中糖、高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)后，細胞趨向形成細胞團簇。加入誘導(dǎo)劑尼克酰胺、Exendin-4后，成團趨勢更加明顯，細胞成團簇狀分布。 3.雙硫腙染色

5、檢測各組細胞胰島素的合成。鏡下觀察，誘導(dǎo)組大部分細胞團被染成棕紅色，而對照組則無染色。表明誘導(dǎo)的細胞胞漿中富含鋅離子，證實胰島素分泌細胞的存在。 4.免疫細胞化學(xué)染色法鑒定各組細胞胰島素的表達。實驗結(jié)果顯示對照組、誘導(dǎo)組隨著葡萄糖濃度的增加，積分光密度值不斷增高，各對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義；低糖誘導(dǎo)組與中糖誘導(dǎo)組之間，低糖誘導(dǎo)組與高糖誘導(dǎo)組之間具有統(tǒng)計學(xué)意義；中糖誘導(dǎo)組和高糖誘導(dǎo)組兩組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。誘導(dǎo)組比對照組積分光

6、密度值明顯增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。 5.透射電鏡觀察誘導(dǎo)前后細胞超微結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果顯示，與誘導(dǎo)前相比，誘導(dǎo)后細胞具備典型分泌細胞特點，胞漿內(nèi)有可見大量圓形、橢圓形大小不等的空泡，粗大的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，線粒體，細胞核不太規(guī)則等改變。 6.各誘導(dǎo)組細胞經(jīng)低糖和高糖刺激后用放射免疫分析法測均有胰島素分泌，而相應(yīng)對照組則無胰島素分泌。低糖誘導(dǎo)組、中糖誘導(dǎo)組、高糖誘導(dǎo)組經(jīng)低糖刺激后，胰島素含量隨著葡萄糖濃度的增加而增加，各組間差異具有統(tǒng)

7、計學(xué)意義。低糖誘導(dǎo)組、中糖誘導(dǎo)組、高糖誘導(dǎo)組經(jīng)高糖刺激后，胰島素含量隨著葡萄糖濃度的增加而增加，組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。各誘導(dǎo)組細胞經(jīng)高糖刺激后則胰島素分泌量增加明顯，高于低糖刺激。 7.Real time-PCR定量分析誘導(dǎo)期結(jié)束后檢測各組細胞有不同程度的胰島β細胞相關(guān)基因GK、PDX-1、ngn3、GLP-1 mRNA的表達，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。GK、PDX-1 mRNA表達水平隨培養(yǎng)基葡萄糖濃度相應(yīng)增高，而ngn3表達情況

8、相反；GLP-1 mRNA表達水平各組不同，與葡萄糖濃度無相關(guān)趨勢。 8.腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)3天后，檢測大鼠血糖。造模組大鼠血糖≥16.7mmol/L且穩(wěn)定兩天，并可觀察到大鼠有明顯多飲、多尿等癥狀，可判斷大鼠糖尿病模型造模成功。各組大鼠糖尿病模型均造模成功。 移植細胞后，應(yīng)用血糖儀檢測尾靜脈血糖，結(jié)果顯示：腎包囊對照組、尾靜脈對照組血糖較移植前無明顯下降，腎包囊組、尾靜脈組移植后第7天開始下降，14天、21天

9、、28天血糖水平下降較移植前明顯。腎包囊組與尾靜脈組血糖下降程度相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。 9.免疫細胞化學(xué)染色法檢測胰島樣細胞Brdu標記率，Brdu標記的細胞胞核顯色為棕紅色，未被標記的細胞胞核復(fù)染為藍色。鏡下隨機挑取五個高倍視野，計數(shù)100個細胞，求其陽性細胞率。Brdu標記率均在95％以上。 10.免疫組織化學(xué)方法檢測移植后Brdu標記細胞及胰島素抗體在各臟器的分布，Brdu標記的細胞在細胞核顯色，為棕黃色或棕黑色

10、，未被標記的細胞胞核復(fù)染為藍色。胰島素抗體主要顯色在胞漿，為棕黃色。 腎包囊組可在腎臟觀察到Brdu標記的細胞，其胰島素表達陽性；在其他臟器未發(fā)現(xiàn)標記細胞，胰島素表達陰性，尾靜脈組可在肺臟、肝臟、腎臟、胰腺觀察到Brdu標記的細胞及相應(yīng)的胰島素表達陽性，在心臟、脾臟、胃則沒有觀察到。在對照組各個臟器都未發(fā)現(xiàn)Brdu標記的細胞及相應(yīng)的胰島素表達陽性。 結(jié)論： 1.通過Percoll密度梯度離心法及貼壁篩選法聯(lián)合應(yīng)用

11、，去除雜細胞效果好，在體外能獲得純化的BMSCs。 2.大鼠BMSCs在尼克酰胺和exendin-4作用下可以誘導(dǎo)分化為胰島樣細胞。加用誘導(dǎo)劑后，短期內(nèi)觀察，高糖培養(yǎng)基效果優(yōu)于低糖組及中糖組。 3.誘導(dǎo)出的胰島樣細胞對葡萄糖刺激具有反應(yīng)性，初步具有模擬體內(nèi)β細胞的生理功能。 4.誘導(dǎo)細胞通過尾靜脈和腎包囊途徑移植入糖尿病大鼠體內(nèi)，可降低大鼠血糖水平。 5.本試驗研究為體外誘導(dǎo)BMSCs，體內(nèi)移植治療糖尿病