心肌營(yíng)養(yǎng)素-1體外誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為心肌樣細(xì)胞的研究.pdf

1、研究背景：
　　 缺血性心臟病是全球高發(fā)的疾病之一，其本質(zhì)是心肌細(xì)胞的不可逆喪失。目前臨床積極進(jìn)行溶栓，介入等再灌注治療，但仍缺乏針對(duì)已經(jīng)梗死心肌細(xì)胞再生的根本性治療方法，梗死心肌形成無(wú)收縮功能的瘢痕組織，導(dǎo)致心功能的改變，最終導(dǎo)致心衰。干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)與再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展為心肌細(xì)胞的再生帶來(lái)了新的希望。其中，成體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)易于獲取、擴(kuò)增，具有多分化潛能，且免疫

2、源性較低，甚至免疫抑制作用，是心肌細(xì)胞再生有前途的種子細(xì)胞。綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)作為活細(xì)胞的熒光標(biāo)記，技術(shù)成熟，應(yīng)用廣泛。攜帶GFP的BMSCs轉(zhuǎn)染率高，熒光便于觀察，是體外活細(xì)胞示蹤的安全、高效的理想標(biāo)記。近年來(lái)，以五氮雜胞苷(5-azacytidine，5-aza)為先驅(qū)和代表，將BMSCs誘導(dǎo)分化為有功能、乃至有電活動(dòng)的心肌細(xì)胞的研究始終在進(jìn)行。新的誘導(dǎo)劑大致分為如下幾類：①細(xì)

3、胞因子類，如血管內(nèi)皮生成因子，胰島素樣生長(zhǎng)因子，肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子等；②炎性因子類如白介素-6，腎素，血管緊張素-Ⅰ，血管緊張素-Ⅱ等；③以及中醫(yī)藥類如黃芪甲甙，雙地龍，丹參酚酮，淫羊藿等。
　　 心肌營(yíng)養(yǎng)素-1(cardiotrophin-1，CT-1)是白介素-6細(xì)胞因子家族的一員，最早發(fā)現(xiàn)其促進(jìn)細(xì)胞肥大的作用，在先天性心臟病、心肌病、進(jìn)行性心力衰竭和心肌梗死等病理過(guò)程中均有過(guò)度表達(dá)。而CT-1誘導(dǎo)大鼠B

4、MSCs向心肌樣細(xì)胞分化的研究亦有進(jìn)行，其結(jié)果提示：CT-1可輔助5-aza提高誘導(dǎo)率，但未能獨(dú)立將BMSCs誘導(dǎo)為心肌細(xì)胞。因此，本課題將研究CT-1在BMSCs誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞中的作用，明確其誘導(dǎo)功效。
　　 研究目的：
　　 本研究旨在探索CT-1在誘導(dǎo)GFP轉(zhuǎn)染的小型豬BMSCs向心肌樣細(xì)胞分化中的作用，通過(guò)觀察分化過(guò)程中的形態(tài)學(xué)變化、研究其生物學(xué)活性及增殖能力、摸索適宜的誘導(dǎo)條件、檢測(cè)心肌細(xì)胞特異蛋白的表達(dá)，

5、以明確CT-1是否對(duì)BMSCs的誘導(dǎo)分化過(guò)程有作用，并為攜帶CT-1基因的BMSCs體內(nèi)移植并在體表達(dá)CT-1作為旁分泌因子刺激干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，且為移植后在體細(xì)胞的生長(zhǎng)分化情況及其改善心功能中作用的觀察提供實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備。
　　 研究方法：
　　 1、獲取、擴(kuò)增穩(wěn)定的成體西藏小型豬BMSCs，繪制生長(zhǎng)曲線，鑒定成脂、成骨潛能
　　 2、用攜帶GFP的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染BMSCs，繪制生長(zhǎng)曲線，鑒定成

6、脂潛能
　　 3、分組誘導(dǎo)分化
　　 將攜帶綠色熒光蛋白的MSC分為：空白對(duì)照組，5-aza組，CT-1組，復(fù)合組，換誘導(dǎo)液作用24小時(shí)后，繼續(xù)原條件培養(yǎng)28天。
　　 4、免疫熒光檢測(cè)以及計(jì)算熒光染色陽(yáng)性率
　　 取誘導(dǎo)后28天的細(xì)胞加肌動(dòng)蛋白(a-actin)，心肌肌鈣蛋白T(cardiac tropponinT，cTnT)一抗行免疫熒光染色，予羅丹明(Tetraethylrhodamine，TRIT

7、C)二抗，再行Hochest法染核。最后計(jì)數(shù)紅色熒光陽(yáng)性染色率。
　　 5、統(tǒng)計(jì)分析：以SPSS13.0軟件統(tǒng)計(jì)，每組檢測(cè)結(jié)果以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 1、BMSCs的培養(yǎng)與鑒定
　　 1.1原代BMSCs的培養(yǎng)與傳代
　　 一周后可見(jiàn)多個(gè)長(zhǎng)梭形細(xì)胞集落，核圓居中，含1-3個(gè)核仁。約12天首次按2*10e4/cm2密度傳代。
　　 1.2

8、 BMSCs的成骨、成脂誘導(dǎo)
　　 取第四代細(xì)胞行成骨誘導(dǎo)21天后鈣化結(jié)節(jié)茜素紅染色陽(yáng)性。成脂誘導(dǎo)14天行油紅O染色，胞核周圍紅染。
　　 2、慢病毒載體攜帶GFP基因轉(zhuǎn)染的BMSCs2.1取第四代細(xì)胞行GFP轉(zhuǎn)染，在熒光下觀察可見(jiàn)表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞約60-80％，轉(zhuǎn)染后增殖速度較前變慢，2.2取第五代GFP-MSC進(jìn)行成脂誘導(dǎo)，14天行油紅O染色，胞核周圍紅染。
　　 3、分組誘導(dǎo)
　　 21天起，可見(jiàn)

9、細(xì)胞生長(zhǎng)減慢，細(xì)胞回縮變短，細(xì)胞聚集生長(zhǎng)趨勢(shì)，細(xì)胞排列具有明顯的方向性，具有短棒狀結(jié)構(gòu)及位于中心的細(xì)胞核，核/漿比例明顯降低，未見(jiàn)細(xì)胞搏動(dòng)。以復(fù)合組變化最為明顯。
　　 4、免疫熒光染色
　　 熒光顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞核均顯示藍(lán)色熒光，約20％細(xì)胞顯示綠色熒光。
　　 a-actin紅色熒光染色結(jié)果顯示：復(fù)合組的誘導(dǎo)分化心肌樣細(xì)胞a-actin陽(yáng)性率為29.900±4.7571％，明顯大于5-aza組(17.7333

10、±2.3459％，p=0.000)、CT-1組(6.6333±0.55076％,p=0.000)和空白對(duì)照組(1.6167±0.08505％，p=0.000)；5-aza組明顯大于CT-1組(p=0.000)和空白對(duì)照組(p=0.000)；CT-1組明顯大于空白對(duì)照組(p=0.028)。
　　 cTnT紅色熒光染色結(jié)果顯示：復(fù)合組的誘導(dǎo)分化心肌樣細(xì)胞cTnT陽(yáng)性率為36.500±4.0927％，明顯大于5-aza組(14.366

11、±1.6502％，p=0.000)、CT-1組(7.5000±0.60828％,p=0.000)和空白對(duì)照組(1.1167±0.22546％，p=0.000)；5-aza組明顯大于CT-1組(p=0.000)和空白對(duì)照組(p=0.000)；CT-1組明顯大于空白對(duì)照組(p=0.003)
　　 結(jié)論：
　　 1.適宜濃度(10umol/l)的5-aza能夠在體外誘導(dǎo)攜帶GFP基因的BMSCs轉(zhuǎn)化為心肌樣細(xì)胞，誘導(dǎo)后的細(xì)胞獲

12、得部分心肌細(xì)胞特異性蛋白的表達(dá)。2.適宜濃度(0.1ng/ml)的CT-1能夠在體外誘導(dǎo)攜帶GFP基因的BMSCs轉(zhuǎn)化為心肌樣細(xì)胞，誘導(dǎo)后的細(xì)胞獲得部分心肌細(xì)胞特異性蛋白的表達(dá)，但誘導(dǎo)率低于5-aza組。
　　 3.CT-1(0.1ng/ml濃度)與5-aza(10umol/l)復(fù)合提高誘導(dǎo)率。
　　 4.經(jīng)上述方案誘導(dǎo)后的細(xì)胞為心肌樣細(xì)胞，未見(jiàn)自主搏動(dòng)。
　　 5.BMSCs體外培養(yǎng)傳至第六代后，經(jīng)28天貼壁培