HDAC1基因沉默的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療大鼠急性心肌梗死的研究.pdf

1、目的：⑴分離、培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs），運用慢病毒感染 BMSCs的方式沉默組蛋白去乙酰化酶1（HDAC1）基因的表達(dá)；⑵探討B(tài)MSCs移植到心肌梗死大鼠心臟梗死區(qū)內(nèi)的方法及療效，觀察HDAC1基因沉默是否可以增加 BMSCs在體內(nèi)的分化能力，能否改善急性心肌梗死后心功能的恢復(fù)；⑶觀察沉默 HDAC1基因是否會影響 BMSCs在體內(nèi)的存活能力以及促血管新生的功能。
　　方法：①全骨髓貼壁法提取大鼠的BMSCs，待細(xì)胞

2、長到80％鋪滿瓶底時結(jié)束原代培養(yǎng)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。運用流式細(xì)胞儀鑒定 P3代細(xì)胞表面標(biāo)志 CD29、CD34、CD44、CD45、CD90的表達(dá)；②篩選出慢病毒最佳的感染條件，以此條件感染BMSCs沉默HDAC1基因，流式細(xì)胞儀檢測感染效率，RT-QPCR、Western Blot檢測HDAC1 mRNA及蛋白表達(dá)水平；③將58只SD大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組（n=10）、心肌梗死組（n=12）、單純BMSCs組（n=18）、HDAC1組（n=

3、18）。結(jié)扎左冠狀動脈前降支制備大鼠心肌梗死模型，1周后單純BMSCs組、HDAC1組再次開胸，以直接心肌內(nèi)注射的方法分別移植BMSCs及HDAC1基因沉默的BMSCs；④4周后測定大鼠心功能，HE染色、Masson染色檢測心臟形態(tài)學(xué)變化、微血管密度以及計算梗死面積比例，并行免疫組織化學(xué)觀察 BMSCs在體內(nèi)的分化情況。RT-QPCR法檢測移植干細(xì)胞中所攜帶的SRY基因mRNA表達(dá)，觀察對比移植細(xì)胞的存活情況。
　　結(jié)果：⑴以全骨

4、髓貼壁法可分離出大鼠BMSCs，通過流式細(xì)胞儀檢測P3代的BMSCs結(jié)果顯示其造血標(biāo)志物 CD34(0.64％)、CD45(0.35％)呈低表達(dá)，而 CD29(99.86％)、CD44(99.47％)、CD90（98.97％）等基質(zhì)細(xì)胞/間質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)志物則呈強(qiáng)表達(dá)，符合間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)的特點；⑵篩選出慢病毒感染最佳的MOI值為100，以此條件感染BMSCs后，流式細(xì)胞術(shù)檢測空載體感染組感染效率為94.22%，siRNA-HD

5、AC1慢病毒載體感染組感染效率為95.07%；RT-QPCR與Western Blot檢測HDAC1 mRNA及蛋白表達(dá)水siRNA-HDAC1慢病毒載體感染組比正常對照組、陰性序列對照組明顯降低（P<0.05）。⑶急性心肌梗死模型成模后1周順利移植相應(yīng)的干細(xì)胞。移植治療4周后，經(jīng)心臟B超檢測顯示，與心梗組（-1.52±3.24%）比較，BMSCs組（5.94±2.21%）與HDAC1組（8.71±3.25%）心功能明顯改善（P<0.0

6、1），而后者改善程度比前者更為明顯（P<0.05）。取心臟標(biāo)本后作形態(tài)學(xué)觀察可見，兩移植組纖維化面積比例（單純BMSCs組23.31±6.17%，HDAC1組23.52±3.78%）均比心梗組（31.68±6.00%）降低（P<0.05），心肌微血管密度（單純BMSCs組200.48±26.79/mm2，HDAC1組216.02±19.37/mm2）明顯高于心梗組（134.29±10.67/mm2）（P<0.01），HDAC1組心梗區(qū)室

7、壁厚度（632±74μm）較BMSCs組增厚（496±112μm）（P<0.05）；⑷兩移植組心肌組織中可以觀察到 GFP陽性細(xì)胞存在，部分標(biāo)記細(xì)胞表達(dá)Troponin-T及 connexin43，移植細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化。RT-QPCR檢測SRY基因追蹤移植干細(xì)胞存活情況，未見兩組中移植細(xì)胞的存活有明顯差異。
　　結(jié)論：①以全骨髓貼壁法在骨髓細(xì)胞群中成功篩選出BMSCs，并使其大量擴(kuò)增滿足動物實驗中移植干細(xì)胞的需要；②以慢病毒感

8、染方式高效阻斷了BMSCs中HDAC1的表達(dá)，可應(yīng)用于后續(xù)的動物實驗。③BMSCs采取直接心肌內(nèi)注射的方法移植后可見其存活在AMI大鼠的心臟組織內(nèi)，并可見其在體內(nèi)向心肌樣細(xì)胞分化；④運用BMSCs移植治療急性心肌梗死可有效促進(jìn)大鼠心功能的恢復(fù)，減少心臟梗死區(qū)的纖維化面積比例，并增加梗死區(qū)的微血管密度；而HDAC1基因沉默通過促使BMSCs向心肌樣細(xì)胞分化的作用，可以緩解梗死區(qū)室壁變薄的情況，改善心肌重塑，進(jìn)一步提高BMSCs移植治療帶來