siRNA沉默Nrf2基因?qū)撬栝g充質(zhì)干細(xì)胞移植治療大鼠急性心肌梗死的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的:核因子E2相關(guān)因子2(Nuclear factor-erythroid2-related factor2, Nrf2)是一種抑制氧化應(yīng)激的轉(zhuǎn)錄因子。本研究采用Nrf2-siRNA﹠EGFP融合基因重組慢病毒載體修飾大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs),觀察體外模擬炎性環(huán)境中沉默Nrf2基因?qū)SCs的生物學(xué)特征的影響;同時在體內(nèi)觀察其對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞參與修復(fù)大鼠急性心肌梗死(Acute

2、 myocardial infarction, AMI)的影響及其相關(guān)機(jī)制,以期為心肌梗死后氧化應(yīng)激環(huán)境的改善及心功能的治療探索新的途徑。
　　方法:
　　體外實(shí)驗(yàn):按本課題組成熟的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行MSCs的體外分離、培養(yǎng)及傳代,并收集第三代(P3)細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀技術(shù)鑒定;購買攜帶EGFP的Nrf2 siRNA慢病毒和空載慢病毒并分別轉(zhuǎn)染MSCs,按實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行或不進(jìn)行缺氧無糖無血清缺氧處理6 h。實(shí)驗(yàn)分為四組:GFP-LV

3、-MSCsNrf2+/-常氧組(簡稱 MSCsNrf2+/-常氧組)、GFP-LV-MSCsNrf2-/-常氧組(簡稱 MSCsNrf2-/-常氧組)、GFP-LV-MSCsNrf2+/-缺氧組(簡稱MSCsNrf2+/-缺氧組)、GFP-LV-MSCsNrf2-/-缺氧組(簡稱MSCsNrf2-/-缺氧組)。分別用熒光表達(dá)、流式細(xì)胞術(shù)確定最佳感染復(fù)數(shù)(Multiplicity of infection, MOI);Western bl

4、ot法檢測各組核蛋白中Nrf2及其下游靶點(diǎn)HO-1的蛋白表達(dá)水平; CCK8法、流式細(xì)胞術(shù)和細(xì)胞免疫熒光法檢測各組細(xì)胞的增殖、凋亡和分化情況;細(xì)胞劃痕試驗(yàn)觀察各組細(xì)胞的遷移能力。
　　體內(nèi)部分:采用結(jié)扎左冠狀動脈前降支建立大鼠心肌梗死模型,60只大鼠隨即均分為溶劑對照組(PBS組)、空載慢病毒組(MSCsNrf2+/-組)和Nrf2沉默組(MSCsNrf2-/-組),建模成功后即刻在心肌梗死交界區(qū)不同點(diǎn)注射2×106/0.3ml的

5、細(xì)胞,注射等體積 PBS溶液作為對照。在心肌梗死模型建立后不同時間點(diǎn),采用伊紅-蘇木素(Hematoxylin Eosin,HE)染色觀察細(xì)胞移植后心肌病理變化,Masson染色檢測心肌組織梗死區(qū)膠原纖維改變,TTC染色檢測心梗面積,細(xì)胞免疫熒光法觀察移植細(xì)胞存活、增殖和分化情況,并行超聲心動圖檢查,觀察心功能各項指標(biāo)的變化。采用Western-blot法檢測各實(shí)驗(yàn)組大鼠心肌梗死區(qū)Nrf2、HO-1、Bcl-2、Bax和MMP9的蛋白表

6、達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　體外實(shí)驗(yàn):流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,所培養(yǎng)的MSCs中CD29、CD90表達(dá)陽性而CD45表達(dá)陰性,符合MSCs特征。Nrf2 siRNA-EGFP重組慢病毒轉(zhuǎn)染MSCs最佳MOI值為20,并在轉(zhuǎn)染后72小時時綠色熒光蛋白表達(dá)最強(qiáng)。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡率,結(jié)果顯示:與其余各組相比, MSCsNrf2-/-缺氧組的細(xì)胞凋亡率顯著增高(P<0.05)。采用CCK8法檢測各組增殖情況和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測

7、各組遷移情況,結(jié)果顯示,與常氧組相比,缺氧組的細(xì)胞增殖速率和細(xì)胞遷移率均顯著下降(P<0.05);與MSCsNrf2+/-缺氧組相比,MSCsNrf2-/-缺氧組的細(xì)胞增殖速率和細(xì)胞遷移率也顯著下降(P<0.05)。細(xì)胞免疫熒光檢測各組CD31表達(dá)情況,結(jié)果顯示,缺氧不能誘導(dǎo)MSCs分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞,且沉默Nrf2對MSCs內(nèi)CD31的表達(dá)無顯著影響。Western bolt檢測各組Nrf2核蛋白和HO-1蛋白表達(dá)水平,結(jié)果顯示:與M

8、SCsNrf2+/-常氧組相比, MSCsNrf2+/-缺氧組表達(dá)水平明顯升高(P<0.05);而與MSCsNrf2+/-缺氧組相比,MSCsNrf2-/-缺氧組表達(dá)則顯著下降(P<0.05);MSCsNrf2+/-常氧組與MSCsNrf2-/-常氧組組間比較無顯著差異(P>0.05)。
　　體內(nèi)實(shí)驗(yàn): HE、Masson和 TTC染色結(jié)果顯示,在心肌梗死模型建立后第28天,與MSCsNrf2+/-組相比,MSCsNrf2-/-組

9、的心肌組織病理病變程度較重(P<0.05),梗死面積增大(P<0.05),但其與PBS組相比并無顯著差異(P>0.05)。組織免疫熒光結(jié)果顯示,在心肌梗死模型建立后第7天,與 MSCsNrf2+/-組相比,MSCsNrf2-/-組凋亡蛋白Caspase3表達(dá)增加。Western blot結(jié)果顯示,與MSCsNrf2+/-相比,MSCsNrf2-/-組梗死區(qū)中Nrf2、HO-1和Bcl-2蛋白表達(dá)下降,Bax、MMP9表達(dá)增加,差異有統(tǒng)計

10、學(xué)意義(P<0.05);但其與PBS組相比,各蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。超聲心動圖結(jié)果顯示,細(xì)胞移植后第28天,與MSCsNrf2+/-組相比,MSCsNrf2-/-組中LVDd和LVDs值增大、EF值下降(P<0.05),差異均有統(tǒng)計學(xué)意義;但MSCsNrf2-/-組與PBS組兩組間各指標(biāo)比較均無顯著性差異(P>0.05)。
　　結(jié)論:采用貼壁篩選法可分離獲得高純度的MSCs,且Nrf2 siRAN/LV可成功轉(zhuǎn)

11、染入大鼠MSCs并使Nrf2基因表達(dá)顯著減少。沉默Nrf2可促進(jìn)MSCs發(fā)生凋亡,降低其缺氧耐受力,且對其分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞無顯著影響。沉默 Nrf2可降低體外模擬炎性環(huán)境中MSCs的增殖速率和遷移速率,但這可能與Nrf2的抗凋亡作用有關(guān);沉默Nrf2也許并不能直接影響MSCs的增殖和遷移,而是通過降低MSCs的細(xì)胞活力從而抑制其增殖和遷移。向心肌梗死大鼠心臟內(nèi)移植一定數(shù)量的MSCs可在一定程度上改善心功能,這與Nrf2在所移植的MSC