Deltex-1基因在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向平滑肌細(xì)胞分化中的作用及其機制研究.pdf

1、研究背景與目的
　　 壓力性尿失禁(stress urinary incontinence，SUI)是指膀胱無自主收縮情況下腹壓突然增高導(dǎo)致尿液不自主流出，也稱真性壓力性尿失禁、張力性尿失禁、應(yīng)力性尿失禁，其特點是正常狀態(tài)下無遺尿，而腹壓增高時尿液不自主流出。主要表現(xiàn)為咳嗽或劇烈運動后出現(xiàn)尿液自尿道外口不自主漏出[1，2]，為女性常見病，其患病率隨年齡增長而增高，嚴(yán)重影響女性生活質(zhì)量。SUI的關(guān)鍵機制是膀胱頸支撐功能障礙與尿道固

2、有括約肌缺陷(intrinsic sphincter deficiency，ISD)。而ISD主要由尿道周圍平滑肌細(xì)胞(smoothmuscle cell，SMC)病變或凋亡所致[3]。
　　 目前SUI的治療方法眾多，但均不能從本質(zhì)上恢復(fù)尿道括約肌功能。近年來，成體干細(xì)胞的移植已成為再生醫(yī)學(xué)的重要手段[4]，為壓力性尿失禁的治療提供了新的策略。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cell

3、s，bMSCs)具有自我更新和多向分化潛能，經(jīng)誘導(dǎo)后在體外可分化為多種細(xì)胞，尤其如SMC。bMSCs取材方便，可直接由骨髓提取，提取后增長速度較快，可自體移植。同時，由于bMSCs具有誘導(dǎo)多向分化性和表觀修飾后能表達(dá)特定外源目的基因等特性，將其用作種子細(xì)胞，用于基因及細(xì)胞治療的前期研究，已成為當(dāng)下熱點。但值得我們關(guān)注的是體外誘導(dǎo)bMSCs向SMC分化的數(shù)量及功能均難以達(dá)到治療SUI的目的。因而，研究其作用機制成為我們研究的重點和方向。<

4、br>　　 MSCs多向分化能力可能涉及多種不同的機制，主要包括三個方面，轉(zhuǎn)錄因子隨機抑制或激活、微環(huán)境誘導(dǎo)分化及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控作用?，F(xiàn)越來越多的研究者發(fā)現(xiàn)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在于細(xì)胞分化中發(fā)揮著重要的作用。目前的研究已經(jīng)揭示了調(diào)控干細(xì)胞命運的三大信號：Notch、Wnt和Shha。其中Notch家族是由高度保守的蛋白質(zhì)組成，是細(xì)胞間實現(xiàn)通訊的重要信號分子。該家族具有受體和基因調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的功能，可通過細(xì)胞間信息的相互傳遞使胞內(nèi)蛋白之間作用而

5、實現(xiàn)信號的調(diào)控。其配體為膜蛋白，脊椎動物體內(nèi)存在多個Notch配體，其中與Deltex同源的稱為Deltex或Deltex-like。在哺乳動物體內(nèi)，Deltex家族包括deltex-1，Deltex-2，Deltex-3，Deltex-4成員。Deltex-1作為Notch信號通路的下游分子，可增強或抑制Notch信號表達(dá)[8]，可通過調(diào)控Notch通路以調(diào)節(jié)淋巴前體細(xì)胞、調(diào)節(jié)神經(jīng)前體細(xì)胞的分化等。Deltex-1蛋白在結(jié)構(gòu)上高度保守

6、，包括三個結(jié)構(gòu)域，DomainⅠ，DomainⅡ和DomainⅢ。DomainⅠ是Deltex-1功能的必須部位，與Notch胞內(nèi)段ANK重復(fù)結(jié)構(gòu)結(jié)合，以調(diào)節(jié)Notch信號[9]；DomainⅡ為脯氨酸聚集區(qū)，與SH3結(jié)合，主要調(diào)節(jié)蛋白與蛋白或蛋白與脂類間的相互作用；DomainⅢ與Deltex-1的降解有關(guān)。
　　 研究表明，Notch通路的激活可促進(jìn)bMSCs向SMC分化[5-6]。Notch信號通路可分為CSL非依賴及CS

7、L依賴兩種途徑。Arias等[7]在研究Notch基因突變時在果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)CSL非依賴途徑，后于哺乳動物體外細(xì)胞實驗中證實。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，Deltex蛋白在介導(dǎo)CSL非依賴的Notch通路中發(fā)揮了重要作用，但其作用機制暫不清楚。因此，本研究探討bMSCs在SMC環(huán)境中deltex-1基因促進(jìn)bMSCs向SMC分化的作用及其機制，為進(jìn)一步研究采用經(jīng)deltex-1基因修飾的bMSCs治療女性壓力性尿失禁奠定基礎(chǔ)。
　　 方法

8、r>　　 本研究擬首先分離、培養(yǎng)與鑒定SD大鼠bMSCs，隨后克隆Deltex-1基因，構(gòu)建其腺病毒載體pAd/Deltex-1，并以此腺病毒載體感染大鼠bMSCs，觀測Deltex-1基因?qū)Υ笫骲MSCs增殖的影響。隨后將經(jīng)Deltex-1基因修飾的bMSCs與SMC共培養(yǎng)，觀測經(jīng)Deltex-1基因修飾的bMSCs在SMC環(huán)境中的變化情況，以此探討Deltex-1基因在bMSCs向SMC分化中的作用及其機制，具體如下。
　　

9、 一、bMSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定
　　 采用密度梯度離心法(percoll，1.073g/ml)分離SD大鼠bMSC，特異性免疫抗體標(biāo)記結(jié)合流式細(xì)胞儀及進(jìn)行成骨、成脂誘導(dǎo)對bMSC的純度與干性予以鑒定。
　　 二、Deltex-1基因腺病毒載體的構(gòu)建及其在大鼠bMSCs中的表達(dá)
　　 1.腺病毒載體pAd/Deltex-1的構(gòu)建、病毒包裝與病毒滴度測定
　　 設(shè)計擴(kuò)增Deltex-1基因引物，以大鼠肝

10、組織總RNA為模板，RT-PCR擴(kuò)增Deltex-1基因的全長編碼序列，構(gòu)建其克隆載體PTA2/Deltex-1，并予以測序鑒定。
　　 以PTA2/Deltex-1為模板，采用KpnⅠ、Xba1酶切位點將Deltex-1基因亞克隆至腺病毒穿梭載體pAdTrackCMV，經(jīng)PmeⅠ酶線性化后，與超螺旋骨架載體pAdEasy-1在BJ5183菌中進(jìn)行同源重組，形成重組腺病毒質(zhì)粒pAd/Deltex-1。
　　 脂質(zhì)體Lip

11、ofectamine-2000介導(dǎo)經(jīng)PacⅠ酶線性化的重組腺病毒質(zhì)粒pAd/Deltex-1的DNA轉(zhuǎn)染健康293細(xì)胞進(jìn)行病毒包裝，倒置顯微鏡觀察，是否可見綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)表達(dá)、病理空斑是否形成、細(xì)胞是否變圓等變化，證實pAd/Deltex-1腺病毒包裝是否成功。
　　 pAd/Deltex-1重組腺病毒經(jīng)293細(xì)胞成功包裝后，經(jīng)5輪傳代擴(kuò)增以提高其滴度，之后大量擴(kuò)增，采

12、用倍比稀釋法測定其滴度。
　　 2.Deltex-1基因在大鼠bMSCs中的表達(dá)檢測
　　 第三代大鼠bMSCs貼壁生長至60%～80%融合后，予以Deltex-1重組腺病毒感染，以空病毒感染的bMSCs作對照。倒置熒光顯微鏡觀察并拍照。在基因(RT-PCR法)與蛋白(Western blot技術(shù))水平檢測Deltex-1在bMSCs中的表達(dá)情況。
　　 三、Deltex-1基因促進(jìn)bMSCs向SMC分化的作用及

13、其機制
　　 1.Deltex-1基因?qū)MSCs增殖的影響-增殖曲線繪制
　　 將經(jīng)Deltex-1基因修飾的bMSCs接種至4個96孔板(3000個細(xì)胞/150μl/孔)，以經(jīng)空病毒與Deltex-1基因干擾片段轉(zhuǎn)染的bMSCs作實驗對照，Scramble-a(CGTTTGTCCCTCCAGCATCT)作用的bMSCs作無關(guān)對照，未作任何處理的bMSCs作正常對照。每組分別于24 h、48 h、72 h取出一96孔板

14、，每孔加換新培養(yǎng)基與CCK-8，相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)4h，振蕩30秒混勻，酶標(biāo)儀測定450 nm波長處光密度值，以光密度值為Y軸，時間為X軸繪制增殖曲線，分析Deltex-1基因?qū)MSCs增殖的影響。
　　 2.免疫熒光組化、RT-PCR及Western blot分析Deltex-1基因在bMSCs向SMC分化中的作用及其機制
　　 將經(jīng)Deltex-1基因修飾的bMSCs與SMC共培養(yǎng)，采用免疫熒光組化染色結(jié)合激光共聚

15、焦、RT-PCR及Western blot觀測經(jīng)Deltex-1基因修飾的bMSCs表達(dá)SMC特異標(biāo)志蛋白α-SMA的情況，具體分組：①bMSC正常對照、②bMSC+空病毒、③bMSC+Deltex-1病毒、④bMSC+空病毒+SMC、⑤bMS C+Deltex-1病毒+SMC、⑥bMSC+Deltex-1干擾+SMC、⑦SMC正常對照。以此探討Deltex-1基因在bMSCs向SMC分化中的作用及其機制。
　　 結(jié)果
　

16、　 一、bMSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定
　　 采用密度梯度離心法分離的SD大鼠初代bMSC，培養(yǎng)24 h后，貼壁生長，呈梭形，培養(yǎng)4～7 d后，挑取其單克隆，傳代擴(kuò)增單克隆bMSCs，置孵箱中培養(yǎng)7～10 d，觀察細(xì)胞長勢良好。
　　 特異性免疫抗體標(biāo)記結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，bMSC的CD90、CD44表達(dá)陽性，分別為99.57%和85.66%，CD45表達(dá)陰性，陽性率為0.35%；成骨誘導(dǎo)后，茜素紅染色發(fā)現(xiàn)，3周后細(xì)

17、胞質(zhì)中出現(xiàn)似鈣沉淀；成脂誘導(dǎo)后，油紅染色發(fā)現(xiàn)，3周左右，細(xì)胞核周可見折光性較強的脂肪小滴出現(xiàn)，繼續(xù)培養(yǎng)一周，脂肪小滴逐漸增多。
　　 二、Deltex-1基因重組腺病毒載體的構(gòu)建及其在大鼠bMSCs中的表達(dá)
　　 1.腺病毒載體pAd/Deltex-1的構(gòu)建、病毒包裝與病毒滴度測定
　　 測序證實，克隆到Deltex-1基因全長編碼序列，成功構(gòu)建其重組腺病毒載體pAd/Deltex-1。
　　 脂質(zhì)體介導(dǎo)

18、重組pAd/Deltex-1病毒DNA轉(zhuǎn)染健康293細(xì)胞進(jìn)行病毒包裝，10 d后，倒置顯微鏡下可見GFP的表達(dá)、病理空斑形成、細(xì)胞變圓、腫脹、脫壁及細(xì)胞核變大等變化，據(jù)此pAd/Deltex-1腺病毒包裝成功。包裝成功的pAd/Deltex-1病毒經(jīng)5輪傳代擴(kuò)增以提高滴度，之后大量擴(kuò)增，采用倍比稀釋法測定其滴度為：1.23×1010IU/mL。
　　 2.Deltex-1基因在大鼠bMSCs中的表達(dá)檢測
　　 從單克隆分

19、離培養(yǎng)的bMSCs，經(jīng)Deltex-1病毒感染，每3～5 d傳1代，傳至第3代，與未經(jīng)感染的bMSCs相比，其形態(tài)無異常改變。倒置熒光顯微鏡觀察可見GFP的較強表達(dá)，對照組則相反。提取此代細(xì)胞的總RNA，并以之為模板，采用R-PCR法可檢測到Deltex-1基因的較強表達(dá)，對照組Deltex-1基因的表達(dá)則較弱。Western blot結(jié)果顯示，感染pAd/Deltex-1病毒的bMSCs檢測，在約67 kDa處出現(xiàn)較強的Deltex-

20、1蛋白相應(yīng)染色帶，對照組的該條帶則較弱。這些結(jié)果提示外源基因Deltex-1能在bMSCs中正常編碼表達(dá)。
　　 三、Deltex-l1因在bMSCs向SMC分化中的作用及其機制
　　 1.Deltex-1基因?qū)MSCs增殖的影響-增殖曲線繪制
　　 第三代bMSCs總的生長趨勢是1～3 d為潛伏期，3～5 d為快速增殖期，6～7 d為平臺期。CCK-8法結(jié)果顯示，各組細(xì)胞的生長趨勢基本與此相符，但經(jīng)Delte

21、x-1基因修飾的bMSCs的增殖，72 h明顯慢于其他組(P<0.01)。
　　 2.免疫熒光組化、RT-PCR及Western blot分析Deltex-1基因在bMSCs向SMC分化中的作用及其機制
　　 將經(jīng)Deltex-1基因修飾的bMSCs與SMC共培養(yǎng)，采用免疫熒光組化結(jié)合激光共聚焦、RT-PCR及Western blot均能檢測到經(jīng)Deltex-1基因修飾的bMSCs較強表達(dá)SMC特異標(biāo)志蛋白α-SMA，正

22、常對照與空病毒感染等組則較弱，經(jīng)Deltex-1基因干擾片段轉(zhuǎn)染的bMSCs幾乎不表達(dá)這些標(biāo)志蛋白。由此提示，Deltex-1基因可促進(jìn)bMSCs向SMC分化。
　　 結(jié)論
　　 1.本實驗成功分離到純度好，干性優(yōu)良的bMSCs；
　　 2.克隆到Deltex-1基因全長編碼序列，成功構(gòu)建其重組腺病毒載體pAd/Deltex-1，該載體得以病毒包裝，并獲得滴度為1.23×1010 IU/mL的高感染力病毒；